در سال های اخیر، داروهای مبتنی بر mRNA توجه قابل توجهی را به خود جلب کرده و تمرکز تحقیقاتی را به خود جلب کرده اند. T7 RNAP به دلیل سادگی و توانایی آن در کاتالیز سنتز RNA با بازده بالا و وفاداری در شرایط آزمایشگاهی با این حال، در طول فرآیند رونویسی، T7 RNAP می تواند محصولات جانبی مانند RNA های کوتاه سقط، RNA های نابهنگام خاتمه یافته و RNA های گسترش یافته 3' تولید کند که شرایط مطلوبی را برای تشکیل dsRNA ایجاد می کند. بنابراین، کاهش تولید dsRNA به یک نیاز فوری در کاربردهای عملی تبدیل شده است.
اخیراً یک مطالعه راهگشا با عنوان "FADS و طراحی نیمه منطقی اصلاح شده T7 RNA پلیمراز تولید dsRNA را با فعالیت ترانسفراز ترمینال و RDRP کاهش داد.توسط Yeasen and Molefuture Team به صورت آنلاین منتشر شد. محققان با موفقیت مهندسی T7 RNAP را انجام دادند تا به طور قابل توجهی تولید محصولات جانبی dsRNA را در طول رونویسی کاهش دهد و آن را به 1.8٪ از آنزیم نوع وحشی از طریق ترکیبی از تکامل هدایت شده و طراحی نیمه منطقی کاهش دهد.
غربالگری T7 RNAP مبتنی بر FADS
برای غربالگری RNAP T7، FADS (مرتب‌سازی قطرات فعال شده با فلورسانس) برای برآورده کردن نیازهای بازده بالا در تکامل پروتئین انتخاب شد. برای جلوگیری از تکه تکه شدن زودرس سلول ها، محققان از یک تراشه PDMS با فازهای آبی دوگانه استفاده کردند که در آن لیزوزیم با سلول های روی تراشه مخلوط شده و فعالیت خود را در داخل قطرات اعمال می کند. شکل 1. محققان چندین کتابخانه جهش یافته تصادفی با تنوعی از 10 ایجاد کردند5 به 106پس از غربالگری، 10 گونه غالب شناسایی و به عنوان Mut1 تا Mut10 تعیین شدند. همانطور که در نشان داده شده است شکل 2E و شکل 2F، محتوای dsRNA Mut1، Mut7 و Mut9 به طور قابل توجهی کمتر از نوع وحشی بود.
شکل 1. نمای کلی FADS
شکل 2. غربالگری تصادفی کتابخانه و ارزیابی انواع
طراحی نیمه منطقی T7 RNAP
محققین یک کاوش طراحی نیمه منطقی انجام داد، ده کتابخانه اشباع شده در یک سایت ایجاد کرد و از روش سنتی پروب دوگانه مبتنی بر صفحه میکروتیتر برای غربالگری استفاده کرد.شکل 3). پروب 5' انتهایی اضافه شده برای تشخیص بازده RNA استفاده می شود.
شکل 3. طراحی نیمه منطقی هدایت ساختار برای کاهش dsRNA
پس از غربالگری بیش از 1000 جهش یافته، محققان شش نامزد را شناسایی کرد: Mut11 (K180E)، Mut12 (S228F)، Mut13 (G238L)، Mut14 (A70Q)، Mut15 (A383H) و Mut16 (I743L). بازده کل RNA هر شش جهش به طور قابل توجهی با نوع وحشی متفاوت نبود، که نشان دهنده کارایی رونویسی کلی قابل مقایسه است. انتظار می رود، محتوای dsRNA Mut11 و Mut14 در مقایسه با نوع وحشی به طور قابل توجهی کمتر بود.شکل 4).
شکل 4. غربالگری پلیت میکروتیتر و ارزیابی انواع
Mut17 از ترکیب DNA dsRNA کمتری تولید می کند
برای بهینه سازی بیشتر T7 RNAP، چهار نوع با محتوای dsRNA پایین در حالی که الزامات تولید را برآورده می کنند، انتخاب شدند.سپس محققان یک کتابخانه ترکیبی DNA ساختند و با صفحات میکروتیتر غربالگری کردند، گونه‌ای را شناسایی کردند که تولید dsRNA کمتری را در مقایسه با T7 RNAP والدینش به نام Mut17 (A70Q/F162S/K180E) نشان می‌داد. آنها متعاقباً محصولات رونویسی Mut17 و انواع والدین آن (Mut14، Mut11 و Mut7) را تجزیه و تحلیل کردند. همانطور که در نشان داده شده است شکل 5، هر چهار نوع کاهش قابل توجهی در تولید dsRNA در طول رونویسی در مقایسه با نوع وحشی نشان دادند. قابل توجه است، Mut17 محتوای dsRNA به طور قابل توجهی کمتر از 1.80٪ و کمتر از 0.007 نانوگرم / میکروگرم در سیستم حلال غربالگری نشان داد.
شکل 5. محتوای dsRNA Mut17 و جهش های والدین آن
ایمنی زایی محصول IVT از جهش یافته به طور قابل توجهی کمتر از نوع وحشی است.
بعد، ما ایمنی زایی محصولات IVT را در RA موش ارزیابی کردیمW264.7 سلول. همانطور که در شکل های 2A و 2B نشان داده شده است، سطوح mRNA و پروتئین IFN-β در RA کاهش یافته است.W264سلول‌های 7. ترانسفکت‌شده با mRNA تولید شده توسط جهش‌یافته‌ها در مقایسه با نوع وحشی، نشان می‌دهد که mRNA سنتز شده توسط T7 RNAP نوع وحشی قوی‌ترین پاسخ ایمنی را ایجاد می‌کند، در حالی که mRNA از جهش‌یافته‌ها پاسخ کاهش قابل‌توجهی نشان می‌دهد. به طور خاص، mRNA IFN-β سلول های تیمار شده با Mut11 RNA تنها 9.7 درصد از سلول های تیمار شده از نوع وحشی بود و پروتئین آن 12.93 pg/mL بود. علاوه بر این، بیان EGFP تفاوت معنی‌داری در کمیت یا کیفیت بین mRNAهای تولید شده توسط RNAPهای مختلف T7 نشان نداد. (شکل 6C)، برآورده کردن الزامات برای کاربردهای صنعتی.
شکل 6. پاسخ IFN-β و بیان EGFP در سلول های پستانداران
فعالیت های RDRP و ترانسفراز ترمینال جهش یافته بسیار کم استماr نسبت به نوع وحشی.
برای بررسی تاثیر جهش بر کاهش dsRNA، محققان در مطالعات سیلیکونی روی همه این جهش ها انجام شد. نتیجه نشان می دهد که نشانه واضحی از کاهش فعالیت RDRP در انواع مختلف است، زیرا آنها تمایل کمتری به استفاده از RNA به عنوان یک الگو را نشان می دهند. به طور مشابه، این ممکن است بر فعالیت ترانسفراز ترمینال T7 RNAP تأثیر داشته باشد. همانطور که در نشان داده شده است شکل 7تحت غلظت‌های مختلف، هر 4 نوع کمتر از 50 درصد از مقدار فلورسانس را در مقایسه با نوع وحشی نشان دادند.
پس از آن، یک سنجش ناهمگنی 3' برای مشخص کردن فعالیت انتقال پایانی T7 RNAP استفاده شد. محققان هنگام تمرکز بر نسبت RNA با n>0 که فعالیت ترانسفراز پایانی را منعکس می کند دریافتند که این RNA ها 82.94٪ در نوع وحشی را تشکیل می دهند، در حالی که جهش یافته ها درصدهای زیر را نشان می دهند: Mut11 (70.29٪)، Mut7 (67.88٪)، Mut14 (63.31٪) و Mut17 (55.62٪) (شکل 8). نکته مهم این است که این درصدها با فراوانی dsRNA در محصولات بسیار سازگار است (شکل 5). این نتایج نشان دهنده کاهش قابل توجهی در فعالیت ترانسفراز ترمینال موتانت ها است که همراه با کاهش فعالیت RDRP، به کاهش dsRNA کمک می کند.به طور خاص، فعالیت ترانسفراز پایانی ممکن است نقش مهم تری ایفا کند، همانطور که با کمترین تجمع n>0 RNA مشاهده شده در Mut17 مشهود است، که همچنین کمترین تولید dsRNA را نشان می دهد. (شکل 5 و شکل 8).
شکل 7. فعالیت نسبی RDRP
شکل 8. ناهمگونی در انتهای 3' محصولات RNA
نتیجه گیری
این مطالعه یک روش قوی برای شناسایی جهش‌یافته‌ها با محتوای dsRNA کاهش‌یافته ارائه می‌دهد و با موفقیت چندین جهش dsRNA را که فعالیت RNA پلیمراز وابسته به RNA و ترانسفراز پایانی را کاهش داده‌اند، جدا می‌کند. این به طور قابل توجهی اعتبار ایمنی و کارایی را که در درمان‌های mRNA ضروری است، تقویت می‌کند و بر پیامدهای عمیق آن برای پیشرفت واکسن‌های mRNA و کاربردهای ژن‌درمانی تاکید می‌کند.
در همان زمان، شرکت مادر Yeasen همچنین یک محصول T7 RNAP را روانه بازار کرده است که به طور قابل توجهی dsRNA را کاهش می دهد محتوا چندین شریک قبلاً جهش یافته‌های T7 RNAP را که توسط Molefuture توسعه داده شده است، آزمایش کرده‌اند و این محصول به شدت توسط مشتریان شناخته شده است. مشتریان ما معتقدند که استفاده از آنزیم جدید فرآیند خالص سازی mRNA را ساده می کند و ایمنی زایی IVT را تا حد زیادی کاهش می دهد محصولات، عملکرد فوق‌العاده‌ای را در سناریوهای کاربردی متعدد نشان می‌دهد و کاربرد بالقوه گسترده آن را در زمینه بیودارویی ثابت می‌کند!
اطلاعات سفارش
محصولات زیر نمایندگی ارائه شده توسط Yeasen می باشد. اندازه های اضافی موجود است. محصولات ما بسیار بهینه شده اند تا به طور هماهنگ کار کنند تا از عملکرد و تکرارپذیری برتر اطمینان حاصل شود. ما همچنین می توانیم خدمات سفارشی ارائه دهیم. اگر به محصولی که نمایش داده نمی شود علاقه مند هستید، با ما تماس بگیرید و ما برای رفع نیازهای شما با شما همکاری خواهیم کرد.