توالی‌یابی نسل بعدی (NGS) چشم‌اندازهای کاربردی تحقیقات بالینی و علمی بسیار گسترده‌ای را در زمینه‌هایی مانند تشخیص پاتوژن، تشخیص جهش تومور و ژنتیک تولید مثلی به دلیل حساسیت بالای تشخیص، ویژگی قوی و توانایی انجام تشخیص کمی و کیفی نشان داده است. ساخت کتابخانه، به عنوان یک مرحله اصلی در NGS، به طور مستقیم بر کیفیت توالی تاثیر می گذارد. بر اساس دستورالعمل های بررسی ثبت نام برای محصولات تشخیصی آزمایشگاهی (IVD)، داده های تحقیقاتی مواد اولیه اصلی باید ارائه شود. یک تحلیل و راستی آزمایی جامع باید با ترکیب عواملی مانند اطلاعات پایه، شاخص های پارامتر و منابع تامین مواد اولیه برای تعیین مناسب ترین منبع مواد اولیه انجام شود. فرآیند ساخت کتابخانه مرسوم DNA و RNA عمدتاً شامل مراحل کلیدی مانند سنتز cDNA، قطعه قطعه شدن DNA، بستن آداپتور و تقویت کتابخانه است. مراحل مختلف شامل انواع مختلفی از آنزیم های مواد خام است. غربالگری آنزیم های مواد خام چرخه تحقیق را طولانی تر می کند. بر این اساس، محصولات ماژول ساخت کتابخانه مقرون به صرفه و ساده به انتخاب جدیدی برای توسعه محصولات IVD تبدیل شده اند.
شکل 1. فرآیند ساخت کتابخانه DNA مرسوم (سمت چپ) و فرآیند ساخت کتابخانه RNA (راست)، با در نظر گرفتن پلت فرم Illumina به عنوان مثال
سنتز رونویسی معکوس بخش اصلی است از RNA-Seq، جدید نوع بالا راندمان ترانس کریپتاز معکوس، که عملکردهای متعددی مانند حساسیت بالا، بالا را ادغام می کند بازده cDNA، و سازگاری با الگوهای ساختارهای پیچیده، یک کانون تحقیقاتی است. پلتفرم اصلاح آنزیم ZymeEditor™ Yeasen یک محصول رونویسی معکوس همه جانبه با عملکرد کاملاً بهبود یافته از طریق اصلاح جهت M-MLV به دست آورده است. می توان از آن در سناریوهای کاربردی متعدد مانند RNA-seq، توالی یابی تک سلولی، شبیه سازی cDNA و ساخت کتابخانه استفاده کرد.
شکل 2. عملکرد 13488ES اعمال شده در RNA-seq
محدود به طول خواندن کوتاه پلت فرم توالی یابی، DNA باید به طور تصادفی قبل از ساخت کتابخانه تکه تکه شود. در مراحل اولیه، تکه تکه شدن آنزیمی به دلیل مشکلات یکنواختی و سوگیری، دلهره آور بود. بیوتکنولوژی Yeasen دو آنزیم تکه تکه شدن منحصر به فرد ایجاد کرده است، یک آنزیم تکه تکه شدن با عملکرد قوی که در دمای 37 درجه سانتیگراد عمل می کند به مدت 3-30 دقیقه و یک آنزیم تکه تکه شدن با اثر ملایم که در دمای 30 درجه سانتیگراد عمل می کند. به مدت 10-40 دقیقه محصولات تکه تکه شدن آنزیمی بر اساس تکه تکه شدن تصادفی به تدریج کاستی های خود را بهبود می بخشند. آنها در محصولات مدولار برای تکه تکه شدن DNA، ترمیم انتهایی و A-tailing ترکیب می شوند که نیازهای متعدد نمونه های مختلف و انواع مختلف توالی یابی را برآورده می کند.
شکل 3. اثرات تکه تکه شدن آنزیم های تکه تکه شدن DNA مختلف: آنزیم تکه تکه شدن با اثر شدید (سمت چپ) و آنزیم تکه تکه شدن با اثر ملایم (راست)
نرخ تبدیل کتابخانه یک شاخص مهم برای ارزیابی کیفیت کتابخانه است، نرخ تبدیل کتابخانه بالا تا حدی به معنای غنی بودن کتابخانه بهتر و یکنواختی بهتر توالی داده ها است. لیگاز DNA معمولی T4 بر بهینه سازی پیوند با کارایی بالا تمرکز دارد، اما قطعات مستعد بستن خود هستند، که نرخ تبدیل کتابخانه را کاهش می دهد و بر غنای کتابخانه و کیفیت توالی تاثیر می گذارد. پلت فرم مهندسی آنزیم Yeasen ZymeEditor ™ تغییرات جهت را روی T4 DNA Ligase برای به دست آوردن یک جهش یافته جدید انجام می دهد. در ترکیب با یک بافر بستن به دقت بهینه‌سازی شده، محصول ماژول بستن با پایداری حرارتی بالا و نرخ خود بستن قطعه کم ایجاد شده است که به طور قابل توجهی نرخ تبدیل کتابخانه را بهبود می‌بخشد.
شکل 4. پایداری حرارتی و تجزیه و تحلیل باقی مانده پیوند دهنده از 12996ES
آنزیم های تقویت PCR همه در روش های آماده سازی کتابخانه NGS مورد نیاز هستند. اکثر DNA پلیمرازهای با وفاداری بالا دارای فعالیت پلیمراز 5'→3' و اگزونوکلئاز 3'→5' هستند. این می تواند DNA را در جهت 5'→3' سنتز کند در حالی که بازهای به اشتباه ترکیب شده را تصحیح می کند. بنابراین، می تواند به سرعت و با وفاداری بالا قطعات DNA را تقویت کند. اما تعداد کمی از آنزیم ها به طور خاص برای NGS طراحی شده اند، محصولات تقویت کتابخانه ای زیادی وجود ندارند که کارآمد، دقیق، خاص و قادر به تقویت اهداف با اندازه های مختلف و محتویات GC بدون بایاس باشند و در عین حال توانایی پیش مخلوط کردن پرایمرها را داشته باشند. Yeasen Biotechnology یک DNA پلیمراز بسیار دقیق با طراحی منحصر به فرد و یک پیش مخلوط PCR شروع گرم بهینه ساخته است، این به طور خاص برای تقویت کتابخانه NGS کارآمد، با وفاداری بالا و کم تعصب طراحی شده است و به چالش های تقویت کتابخانه NGS پیچیده می پردازد.
شکل 5. تجزیه و تحلیل نرخ خطای پایداری و تقویت 12980ES
علاوه بر سری فوق ماژول ساخت کتابخانه NGS، ما همچنین محصولات آنزیمی خام یک مرحله ای را ارائه می دهیم، برای برآوردن نیازهای ترکیبی مشتریان مختلف. محصولات مواد اولیه ساختمانی کتابخانه NGS Yeasen تحت استانداردهای کنترل کیفیت کارخانه، عملکرد دسته ای دقیق و کنترل کیفیت پایداری قرار دارند، به طوری که می توانید بدون نگرانی کتابخانه بسازید.
| دسته بندی محصول | نام محصول | گربه شماره | تذکر دهید |
| سنتز cDNA کارآمد | Hifair™ ترانس کریپتاز فوق معکوس (U/μL 200) | 14604ES | آنزیم رونویسی معکوس |
| Hieff NGS™ کیت سنتز ds-cDNA | 13488ES | ماژول سنتز cDNA | |
| DNA تکه تکه شدن و ترمیم انتهایی و A- Tailing | Hieff™ Smerase | 12907ES | DNA fragmentase |
| ماژول تکه تکه شدن DNA Hieff NGS™ OnePot Pro (تعمیر پایان و dA-tailing plus) | 12619ES | DNA ماژول Fragmentation & End-Repair & A- Tailing | |
| تعمیرات و A-Tailing | Hieff NGS® Fast-Pace End Repair/dA-Tailing Module | 12608ES | ماژول End-Repair & A- Tailing |
| بستن آداپتور | 10299ES | T4 DNA لیگاز | |
| تقویت کتابخانه | 2× Ultima HF Amplification Mix | 13344ES | آنزیم با کیفیت بالا |