در توالی یابی با توان عملیاتی بالا، ساخت کتابخانه معمولی نیاز به تقویت PCR دارد. از یک سو، تقویت نمونه های DNA ردیابی و افزایش بازده کتابخانه است. از سوی دیگر، می‌تواند سیگنال‌های فلورسنت را تقویت کند، و ضبط و شناسایی سیگنال‌های فلورسنت را برای ترتیب‌دهنده‌ها آسان‌تر می‌کند تا دقت توالی‌یابی را بهبود بخشد. با این حال، PCR مانند یک "شمشیر دو لبه" است. ضمن حل مشکل حجم نمونه اولیه کم و تقویت سیگنال فلورسنت، خطاها و بایاس های تقویت را نیز معرفی می کند و نمی تواند توالی ژنوم "True Face" را به طور کامل ارائه دهد. علاوه بر این، پلیمراز PCR دارای بایاس تقویت خاصی است. برخی از مناطق، به ویژه GC بالا یا پایین، ساختار ثانویه، و مناطق دیگر، دارای راندمان تقویت پایین هستند و پوشش آن دشوار است. همچنین تعداد زیادی InDels اشتباه را معرفی می کند و تعداد زیادی Duplication را به ارمغان می آورد. ، باعث هدر رفتن حجم داده های DNA و افزایش هزینه توالی یابی می شود. بنابراین، معرفی تکنولوژی PCR-Free نه تنها مزایای PCR را دارد، بلکه کاستی های PCR را نیز برطرف می کند. این نه تنها می‌تواند کتابخانه‌های با کیفیت بالا با حساسیت بالا به ارمغان بیاورد، و تشخیص نمونه‌های ردیابی را درک کند، بلکه دقت بالایی دارد و حجم کار اعتبارسنجی بعدی را برای مطالعات مختلف کاهش می‌دهد. پس دقیقاً کتابخانه PCR-Free چیست و چه مزایایی دارد؟

1. کتابخانه بدون PCR چیست؟
2. مزایای فناوری PCR-Free چیست؟
3. نمایش داده های PCR-Free
4. سوالات متداول
5. اطلاعات محصول
6. در مورد خواندن

1. کتابخانه بدون PCR چیست؟

فناوری توالی یابی نسل بعدی متداول ترین فناوری مورد استفاده در تحقیقات توالی یابی با توان بالا در زیست شناسی مولکولی مدرن است. توالی یابی نسل اول سنتی دیگر نمی تواند نیازهای محققان را به طور کامل برآورده کند. توالی‌یابی ژنوم ارگانیسم‌های مدل و توالی‌یابی ژنوم موجودات غیرمدل نیاز به هزینه بیشتری دارد. فناوری توالی یابی کم، توان بالاتر، سریعتر، در نتیجه نسل دوم فناوری توالی یابی را به وجود آورد. اصل اصلی فناوری توالی‌یابی نسل دوم، توالی‌یابی به سنتز است، یعنی تعیین توالی DNA با گرفتن اطلاعات پایه برچسب‌گذاری شده انتهایی جدید سنتز شده. اصل اصلی فناوری توالی یابی نسل دوم برای توالی یابی DNA این است که ابتدا DNA را قطعه قطعه می کنیم، انتهای DNA قطعه قطعه شده را ترمیم می کنیم و سپس آداپتورهای خاصی را در هر دو طرف اضافه می کنیم و سپس از روش های مختلف برای تولید میلیون ها PCR ثابت مکانی استفاده می کنیم. برای آرایه‌های کلونال، داده‌های توالی‌یابی با استفاده از هیبریداسیون پرایمر و واکنش‌های گسترش آنزیمی برای تصویربرداری از برچسب‌های فلورسنت گنجانده شده توسط هر واکنش گسترش به‌دست می‌آیند.

توالی یابی DNA توسط توالی یابی نسل بعدی عمدتاً شامل دو فرآیند است: آماده سازی کتابخانه و توالی یابی روی ماشین. در طول آماده سازی کتابخانه، قطعات ژنومی به طور تصادفی قطع شده معمولاً با PCR استاندارد تکثیر می شوند. با این حال، برای برخی از الگوهای خاص، عواملی مانند ساختار ثانویه پیچیده یا پایداری حرارتی ضعیف وجود دارد که بر ترجیح تقویت الگوی PCR تأثیر می‌گذارد، بنابراین همه توالی‌های ژنومی نمی‌توانند به طور یکسان در کتابخانه تقویت PCR منعکس شوند. به خصوص برای برخی از الگوها با محتوای GC یا AT بالا، گاهی اوقات استفاده از روش PCR برای تقویت برای ساخت کتابخانه دشوار است. هیچ تفاوتی بین کتابخانه بدون PCR و کتابخانه PCR معمولی هنگام تعیین توالی روی دستگاه وجود ندارد، به جز اینکه PCR در طول فرآیند ساخت کتابخانه انجام نمی شود. کتابخانه بدون PCR از نظر تئوری می تواند توزیع داده های خوانده شده را بهبود بخشد و پوشش ژنوم یکنواخت تری ایجاد کند.کتابخانه بدون PCR مکمل روش ساخت کتابخانه است. از آنجایی که مستقیماً در یک کتابخانه داخلی بدون تقویت PCR آماده می شود، می تواند پوشش برخی از مناطق با GC یا AT بالا را بهبود بخشد، در نتیجه پایه های خطای معرفی شده توسط PCR، بایاس داده و تکرار توالی را کاهش می دهد.

مراحل اصلی ساخت کتابخانه معمولی NGS عبارتند از تکه تکه شدن ژنوم، تعمیر انتهایی، افزودن آداپتور، PCR و تقویت سیگنال قبل از تعیین توالی. بنابراین، در مورد ساخت کتابخانه بدون PCR چطور؟ همانطور که از نام آن پیداست، این یک فرآیند کتابخانه سازی است که نیازی به PCR ندارد. مراحل اصلی ساخت کتابخانه عبارتند از تکه تکه شدن ژنوم، اصلاح انتهایی، افزودن پیوند دهنده و کنترل کیفیت کتابخانه. اما در واقع، این تنها می تواند به عنوان بدون PCR در فرآیند ساخت کتابخانه در نظر گرفته شود. بدون PCR واقعی باید فرآیندی از ساخت کتابخانه تا توالی یابی بدون تقویت کتابخانه (مانند فناوری توالی یابی تک مولکولی) یا یک فناوری توالی یابی بدون تجمع خطاهای تقویت PCR (مانند DNBseq MGI) باشد.

شکل 1. نمودار جریان ساخت کتابخانه معمولی و ساخت کتابخانه بدون PCR

2. مزایای فناوری PCR-Free چیست؟

در فرآیند ساخت کتابخانه معمولی، آنزیم تقویت ممکن است خطاهایی ایجاد کند. از طریق تقویت چرخه ای، این خطاها انباشته و تقویت می شوند و وفاداری تکرار توالی DNA را کاهش می دهند. علاوه بر این، DNA پلیمراز همچنین دارای یک سوگیری تقویتی خاص است، به ویژه برای مناطقی با تفاوت های بزرگ در محتوای GC یا ساختارهای ثانویه، که منجر به راندمان تقویت پایین و یکنواختی پوشش ضعیف می شود. در حالی که InDels اشتباه معرفی می شود، تعداد زیادی از Duplication باعث هدر رفتن حجم داده های DNA و افزایش هزینه های توالی می شود. فناوری PCR-Free به خوبی می تواند از مشکلات فوق الذکر که توسط تقویت PCR در ساخت و ساز کتابخانه معمولی معرفی شده است، جلوگیری کند. در فرآیند ساخت و توالی یابی کتابخانه، اگر فرآیند تقویت PCR وجود داشته باشد، تأثیر بیشتری بر یکنواختی پوشش ژنوم خواهد داشت. برای الگوهای DNA، برخی ساختارهای ثانویه پیچیده دارند و برخی تفاوت های زیادی در پایداری حرارتی دارند. این عوامل بر راندمان تقویت PCR تأثیر خواهند گذاشت. بنابراین، در فرآیند تکثیر PCR، نمی توان تضمین کرد که تمام قطعات ژنومی می توانند بازده تکثیر یکسانی را به دست آورند، اما یک سوگیری تقویت آشکار وجود دارد، مانند پوشش کم در مناطق GC بالا یا GC پایین ژنوم. با این حال، هیچ PCR در کل فرآیند توالی یابی بدون PCR وجود ندارد. در مقایسه با ساخت کتابخانه PCR، پوشش مناطق GC بالا و مناطق تکرار AT/TA ژنوم بهبود یافته است. مزایای خاص به شرح زیر است.

2.1 فرآیند آماده سازی کتابخانه ساده، صرفه جویی در زمان

آماده سازی کتابخانه بدون PCR، نیاز به تقویت PCR و سایر مراحل را از بین می برد، فرآیند آماده سازی کتابخانه را ساده می کند و در زمان صرفه جویی می کند.

2.2 کاهش هزینه آماده سازی کتابخانه

در فرآیند آماده سازی کتابخانه مرسوم، آنزیم های گران قیمت با وفاداری بالا برای تقویت PCR استفاده می شود تا از صحت توالی اطمینان حاصل شود. در عین حال، PCR-Free مرحله تقویت PCR را حذف می کند و هزینه های آماده سازی کتابخانه را کاهش می دهد.

2.3 کاهش بایاس تقویت

آنزیم‌های تقویت DNA دارای سوگیری‌های تقویتی خاصی هستند، به‌ویژه برای الگوهایی که تفاوت‌های قابل‌توجهی در محتوای GC یا ساختار ثانویه دارند. بنابراین، PCR-Free می تواند به طور موثری از بایاس تقویت ناشی از پلیمراز جلوگیری کند.

2.4 عدم تکرار PCR

PCR-Free می تواند خواندن های تکراری را کاهش دهد و نرخ نقشه برداری منحصر به فرد و استفاده موثر از داده ها را افزایش دهد.

2.5 کاهش خطا

تقویت PCR به احتمال زیاد خطاهای تکراری Insertion & Deletion را ایجاد می کند که منجر به نرخ خطای بالاتر توالی یابی Indel می شود، در حالی که PCR-Free می تواند به طور موثری از تولید و تجمع چنین خطاهایی جلوگیری کند.

3. نمایش داده های PCR-Free

کیت آماده سازی کتابخانه DNA رایگان Hieff NGS™ Ultima Pro PCR V2 (Cat# 12196ES) نرخ تبدیل کتابخانه بهتری نسبت به محصولات رقیب دارد.

شکل 2. مقدار داده های توالی یابی خارج از ماشین برای ساخت کتابخانه بدون PCR

4. سوالات متداول

س: چه نوع نمونه هایی برای کتابخانه های بدون PCR مناسب هستند؟

پاسخ: برخی از نمونه‌ها با ساختارهای ثانویه پیچیده، GC بالا و ترجیح PCR می‌توانند کتابخانه‌ای بدون PCR را برای ساخت انتخاب کنند.

س: اندازه قطعه کلی کتابخانه بدون PCR چقدر است؟

پاسخ: خود کتابخانه بدون PCR هیچ الزام خاصی در اندازه قطعه ندارد. کتابخانه محصول PCR، کتابخانه با توجه به اندازه محصول PCR ساخته شده است. برای کتابخانه ژنومی توصیه می شود در حدود 350bp باشد تا کیفیت داده های کتابخانه نسبتاً خوب باشد.

5. اطلاعات محصول

محصولی که Yeasen می تواند ارائه دهد در جدول 1 نشان داده شده است.

جدول 1. اطلاعات محصول

6. در مورد خواندن

محلول آماده سازی کتابخانه NGS از نمونه های DNA

در مورد فناوری مرتبط با NGS، چقدر می دانید؟