هیف^™ Fast Cell Direct کیت RT-qPCR مبتنی بر رنگ سبز SYBR برای استخراج RNA از انواع سلول‌های حیوانی (مانند سلول‌های دیواره سلولی و سلول‌های تعلیق، سلول‌های کشت اولیه، سلول‌های بنیادی مختلف، سلول‌های iPS و غیره) بدون نیاز به استخراج RNA مناسب است و می‌تواند مستقیماً برای تجزیه و تحلیل بیان qPCR مورد استفاده قرار گیرد که کوتاه، کارکرد آسان و نرخ خطای پایینی دارد. تکمیل مراحل از آماده سازی الگو تا واکنش رونویسی معکوس و تجزیه و تحلیل بیان ژن تنها 1.5 ساعت طول می کشد.

رونویسی معکوس و معرف های تشخیص فلورسانس در کیت گنجانده شده است که می تواند برای تجزیه و تحلیل بیان ژن بدون نیاز به خرید معرف های اضافی استفاده شود.

مشخصات

اجزاء

ذخیره سازی

FCD Lysis Buffer و FCD Washing Buffer ذوب شده و در دمای 4 درجه سانتیگراد نگهداری شدند تا از آلودگی جلوگیری شود. محلول توقف FCD، DNase I، 4× Hifair™ FCD RT Mix، 2× Hieff™ FCD qPCR SYBR Master Mix باید در دمای -25 تا -15 درجه سانتیگراد ذخیره شود.

دستورالعمل ها

1. تهیه محصولات شکاف

1) 1. معرف را در دمای اتاق ذوب کنید، آن را وارونه کرده و قبل از استفاده به آرامی مخلوط کنید و پس از سانتریفیوژ جزئی از آن استفاده کنید تا کف نکند*.

*عدم اختلاط معرف ها، استفاده از یک نوسان ساز برای اختلاط و عدم پیکربندی معرف ها روی یخ می تواند منجر به کاهش عملکرد واکنش شود.

2) بسته به نوع سلول**، سلول ها را به لوله سانتریفیوژ منتقل کرده و با سرعت 5000 دور در دقیقه به مدت 2 دقیقه سانتریفیوژ کنید تا سلول ها جمع آوری شده و محیط به خوبی آسپیره شود. اگر سلول ها در صفحات 96 چاهی کشت شوند، محیط را می توان مستقیماً آسپیره کرد.

3) 150 میکرولیتر از بافر شستشوی FCD را به هر چاهک اضافه کنید، سلول ها را با دمیدن بشویید، با دور 5000 به مدت 2 دقیقه سانتریفیوژ کنید و بافر شستشوی FCD را آسپیره کنید***.

4) 48 میکرولیتر محلول بافر FCD Lysis و 2 میکرولیتر محلول DNase Ⅰ را به هر چاهک اضافه کنید، باد کرده و در دمای اتاق مخلوط کنید، سپس بگذارید 5 دقیقه بماند و سپس 2 عدد اضافه کنید.5 میکرولیتر از محلول توقف FCD پس از انکوباسیون****، و سپس باد کرده و حدود 5 بار مخلوط کنید تا محصول برش را بدست آورید*****.

** نیاز اساسی برای تعداد سلول ها 1 × 10 است⁴ سلول در هر چاهک، و این کیت را می توان در محدوده 1 × 10 استفاده کرد³ - 1 × 10⁶ سلول ها اگر تعداد سلول ها بیشتر باشد، مقدار محلول FCD Lysis Buffer و محلول DNaseⅠ را می توان به طور متناسب افزایش داد.

*** شرایط سانتریفیوژ از سلولی به سلول دیگر متفاوت است، بنابراین لطفاً با سرعت مناسب برای سلول های مورد استفاده سانتریفیوژ کنید.

**** 2.5 میکرولیتر محلول توقف FCD را به 50 میکرولیتر لیزات اضافه کنید و در صورت نیاز مقدار محلول توقف FCD را افزایش دهید.

***** برای نگهداری طولانی مدت محلول های محصول لیز سلولی، آن را در دمای 20- درجه سانتی گراد قرار دهید.

5) 4 x Hifair™ FCD RT را در دمای اتاق ذوب کنید و با کمی وارونگی مخلوط کنید، روی یخ بگذارید و سیستم واکنش را مطابق جدول زیر پیکربندی کنید:

*******میزان مصرف توصیه شده 2-5 میکرولیتر است، سعی کنید از 45% تجاوز نکنید.

1. رونویسی معکوس

محلول واکنش آماده شده در بالا را با پیپت و به آرامی مخلوط کنید و واکنش رونویسی معکوس را طبق روش جدول زیر انجام دهید:

* دمای رونویسی معکوس توصیه شده 55 درجه سانتی گراد است. برای الگوهای با محتوای GC بالا یا الگوهای پیچیده، دمای رونویسی معکوس را می توان تا 60 درجه سانتی گراد افزایش داد. محصول رونویسی معکوس می تواند مستقیماً برای تشخیص پایین دستی RT-qPCR استفاده شود. به منظور جلوگیری از مهار واکنش qPCR توسط سیستم رونویسی معکوس و به دست آوردن مقدار Ct مناسب (35-10)، می توان محصول را 10-1000 بار رقیق کرد و سپس استفاده کرد. اگر آزمایشات پایین دستی برای مدت کوتاهی انجام نشود، می توان آن را در دمای -20 درجه سانتیگراد برای ذخیره سازی قرار داد.

1. فلورسانس کمی PCR

1) واکنش سیستم پیکربندی

نسبت های زیر برای تهیه محلول واکنش (تهیه روی یخ) توصیه می شود.

*بیش از 1/10 حجم RT-qPCR محصول رونویسی معکوس اضافه نکنید. غلظت بالای قالب به راحتی منجر به تقویت غیر اختصاصی، رقت مناسب 5-50 بار می شود. مقدار پیشنهادی الگو 4 میکرولیتر است، سعی کنید از 6 میکرولیتر تجاوز نکنید. هنگامی که عملکرد واکنش ضعیف است، غلظت پرایمر را می توان در محدوده 0.2-1.0 میکرومول در لیتر تنظیم کرد.

2)روش تقویت PCR کمی فلورسانس (روش دو مرحله ای)

3) روش تقویت سریع برای PCR کمی فلورسنت (روش دو مرحله ای)

* دمای بازپخت / گسترش و زمان گسترش نهایی را می توان به طور مناسب با توجه به نیازهای آزمایشی تنظیم کرد. برنامه سریع برای اکثر ژن ها مناسب است و برنامه استاندارد را می توان برای ژن های ساختار ثانویه پیچیده جداگانه امتحان کرد.

یادداشت ها

1. این محصول فقط برای استفاده تحقیقاتی است.
2. لطفا برای ایمنی خود با کت های آزمایشگاهی و دستکش های یکبار مصرف کار کنید.

نسخه EN20230908

اسناد:

دفترچه راهنما

11172-Hieff™ Fast Cell Direct. EN20230908.pdf