شرح
هیف NGSTM OnePot Pro DNA Library Prep Kit V3 یک کیت آماده سازی کتابخانه مبتنی بر تکه تکه شدن آنزیمی است. به طور ویژه برای ایلومینا پلت فرم توالی یابی &MGI. در مقایسه با روش‌های سنتی ساخت کتابخانه، این محصول از آنزیم‌های تکه تکه‌شدن با کیفیت بالا استفاده می‌کند که فرآیند دست و پا گیر اولتراسونیک را حذف می‌کند. این کار را با ترکیب ماژول های تکه تکه شدن و تعمیر نهایی در یک واحد ساده می کند. علاوه بر این، آنزیم‌ها و بافر برای ماژول بستن از قبل مخلوط شده‌اند و به طور قابل توجهی زمان و هزینه ساخت کتابخانه را کاهش می‌دهند. این امر آن را برای ساخت کتابخانه خودکار مناسب تر می کند. این کیت آماده سازی کتابخانه دارای نرخ تبدیل کتابخانه ای عالی است و برای نمونه هایی از همه حیوانات معمولی، گیاهان، میکروارگانیسم ها و غیره و همچنین نمونه های FFPE قابل استفاده است. بر اساس نسل قبلی کیت ساخت کتابخانه، این محصول کارایی بالاتری را در قطعه بندی نشان می دهد. تعمیر انتهایی، dA-tailing و بستن آداپتور نسبت به نسخه های قبلی. آنزیم با وفاداری بالا به طور قابل توجهی یکنواختی و وفاداری تقویت را بهبود می بخشد.
مشخصات
| گربه شماره | 12194ES08 / 12194ES24 / 12194ES96 |
| اندازه | 8 T / 24 T / 96 تی |
اجزاء
| اجزای شماره | نام | 12194ES08 | 12194ES24 | 12194ES96 |
| 12194-الف | لکه دار کردنTM بافر 3.0 | 80 میکرولیتر | 240 میکرولیتر | 960 میکرولیتر |
| 12194-ب | لکه دار کردنTM آنزیم 3.0 | 80 میکرولیتر | 240 میکرولیتر | 960 میکرولیتر |
| 12194-C | میکس آماده بستن | 200 میکرولیتر | 600 میکرولیتر | 3×800 میکرولیتر |
| 12194-د | 2× Ultima HF Amplification Mix | 200 میکرولیتر | 600 میکرولیتر | 3×800 میکرولیتر |
[توجه داشته باشید]: اجزای کیت با هر دو سازگار است ایلومینا &MGI پلت فرم توالی، اگر آداپتور کامل باشد استفاده شد، هیف NGSTM مخلوط پرایمر (Yeasen Cat#12190 یا Cat#12191) مورد نیاز است.
ذخیره سازی
این محصول باید در دمای -25 تا 15 درجه سانتیگراد نگهداری شود 1 سال
یادداشت ها
1. در مورد عملیات
1. لطفا با کت آزمایشگاه و دستکش یکبار مصرف کار کنید،برای امنیت شما
2. اجزاء را در دمای اتاق ذوب کنید. پس از ذوب شدن، با گرداب کردن، لوله را کاملاً مخلوط کنید، لوله را برای مدت کوتاهی بچرخانید و برای استفاده بعدی روی یخ قرار دهید.
3. هنگام تهیه محلول واکنش هر مرحله، توصیه می شود از یک پیپت برای مخلوط کردن خوب یا تکان دادن ملایم استفاده کنید. تکان دادن شدید ممکن است باعث کاهش خروجی کتابخانه شود.
4. برای جلوگیری از آلودگی متقاطع، استفاده از نوک پیپت فیلتر شده به شدت توصیه می شود. هنگام پردازش نمونه های مختلف حتما نوک پیپت را عوض کنید.
5. عملیات نامناسب ممکن است به احتمال زیاد باعث آلودگی آئروسل شود و بر دقت نتیجه تأثیر بگذارد. جداسازی فیزیکی اجباری مناطق اختلاط واکنش PCR و نواحی سنجش تصفیه محصول PCR توصیه می شود. مجهز به تجهیزاتی مانند پیپت‌های تخصصی برای ساخت کتابخانه
6. این محصول فقط برای استفاده تحقیقاتی است.
2. تکه تکه شدن DNA
1. این کیت با 100 pg سازگار است - 1000 نانوگرم DNA ورودی استفاده از DNA ورودی با کیفیت بالا با A260/A280 = 1.8-2.0 به شدت توصیه می شود.
2. آزمایش‌های زیر می‌توانند تحت تأثیر قرار گیرند اگر غلظت‌های بالایی از نمک‌ها مانند عامل کیلیت فلزی با DNA ورودی معرفی شوند. توصیه می کنیم نمونه DNA را در آن شستشو دهید ddH2O برای تکه تکه شدن
3. لطفا به جدول مراجعه کنید 6 برای زمان تکه تکه شدن نمونه های استاندارد DNA. این کیت دارای سوگیری تکه تکه شدن کم است و پوشش GC یکنواخت را برای نمونه های DNA با طیف گسترده ای از ترکیبات GC فراهم می کند. لطفاً زمان تکه تکه شدن را بر اساس نیازهای آزمایشی خود تنظیم کنید.
4. برای تکه تکه شدن دقیق، لطفا واکنش را روی یخ آماده کنید.
3. اتصال آداپتور
1. کیت‌های آداپتور بلند Illumina یا MGI (آداپتور بارکد) و کیت‌های آداپتور کوتاه برای مشتریان در دسترس هستند تا با توجه به نیازهای آزمایشی خود انتخاب کنند.
2. انتخاب آداپتورهای تجاری با کیفیت بالا توصیه شد. اگر آداپتورهای خودساخته انتخاب شده‌اند، لطفاً به یک شرکت با تجربه در سنتز پرایمر NGS اعتماد کنید و به نیاز به کنترل دقیق آلودگی توجه کنید. علاوه بر این، توصیه می شود محلول آنیل DNA را در یک نیمکت تمیز تهیه کنید و هر بار فقط یک نوع آداپتور را برای جلوگیری از آلودگی متقاطع کار کنید.
3. لطفاً آداپتورها را روی یخ یا در دمای 4 درجه سانتیگراد ذوب کنید. هنگام کار در دمای اتاق، دمای آزمایشگاه نباید از 25 درجه سانتیگراد تجاوز کند تا از دناتوره شدن آداپتورها جلوگیری شود.
4. کیفیت و غلظت آداپتورها مستقیماً بر راندمان بستن و بازده کتابخانه تأثیر می گذارد. غلظت بیش از حد آداپتورها به نفع تشکیل دایمر آداپتور است در حالی که آداپتور بسیار کم سرعت بستن و بازده کتابخانه را کاهش می دهد. رقت های مربوطه با بافر TE با توجه به مقدار DNA ورودی هنگام استفاده از آداپتور. جدول 1-2 روش های رقیق سازی توصیه شده برای آداپتورهای معمولی و UMI را برای مقادیر مختلف DNA ورودی با استفاده از این کیت برای پلتفرم های توالی یابی Illumina یا MGI فهرست می کند.
جدول 1 ایلومینای توصیه شده مقدار آداپتور برای ورودی های مختلف DNA
| ورودی DNA | سینسبت رقت آداپتور معمولی | تمرکز | نسبت رقت آداپتور UMI | تمرکز |
| ＜1 نانوگرم | 7.5 برابر | 2 μM | 15- برابر | 1 μM |
| 1 ng ~ 10 نانوگرم | 3- برابر | 5 μM | 3- برابر | 5 میکرومولار |
| 10 ng ~ 200 ng | 1.5 برابر | 10 μM | 2- برابر | 7.5 میکرومولار |
| ＞200 نانوگرم | 0-تا کنید | 15 میکرومولار | 0-تا کنید | 15 میکرومولار |
جدول 2 توصیه می شود MGI مقدار آداپتور برای ورودی های مختلف DNA
| ورودی DNA | سینسبت رقت آداپتور معمولی | تمرکز | نسبت رقت آداپتور UMI | تمرکز |
| ＜1 نانوگرم | 5- برابر | 2 μM | 10- برابر | 1 μM |
| 1 ng ~ 10 نانوگرم | 2- برابر | 5 μM | 2- برابر | 5 میکرومولار |
| 10 ng ~ 200 ng | 0-تا کنید | 10 μM | 1.25- برابر | 8 μM |
| ＞200 نانوگرم | 0-تا کنید | 10 μM | 0-تا کنید | 10 μM |
4. پاکسازی DNA و انتخاب اندازه مبتنی بر مهره
1. انتخاب اندازه DNA را می توان قبل از ترمیم انتهایی / dA-tailing، پس از بستن آداپتور، یا پس از تقویت انجام داد.
2. اگر مقدار DNA ورودی بیش از 50 نانوگرم باشد، بلافاصله پس از بستن آداپتور، انتخاب اندازه توصیه می شود. در غیر این صورت، لطفا انتخاب اندازه را پس از تقویت انجام دهید.
3. Ligation Enhancer حاوی غلظت بالایی از PEG است که ممکن است تأثیر قابل توجهی در انتخاب دقیق اندازه داشته باشد. بنابراین، اگر قرار است انتخاب اندازه درست بعد از بستن آداپتور انجام شود، اکیداً توصیه می‌شود که قبل از انتخاب اندازه، یک مرحله تمیز کردن دانه‌ها اضافه شود. مرحله انتخاب اندازه را می توان به طور مستقیم انجام داد اگر قبل از پایان تعمیر / dA-tailing یا بعد از آن انجام شود تقویت کتابخانه
4. دانه های مغناطیسی باید قبل از استفاده در دمای اتاق متعادل شوند، در غیر این صورت بازده کاهش می یابد و اثر انتخاب اندازه تحت تأثیر قرار می گیرد.
5. دانه های مغناطیسی باید قبل از استفاده با گرداب یا پیپت به خوبی مخلوط شوند.
6. هنگام انتقال مایع رویی، دانه ها را آسپیره نکنید، حتی مقادیر کمی از دانه ها ممکن است بر واکنش های زیر تأثیر بگذارد.
7. اتانول 80% باید تازه تهیه شود، در غیر این صورت بر راندمان بازیابی تأثیر می گذارد.
8. برای انتخاب دقیق اندازه، توصیه می شود با حجم بیش از 100 میکرولیتر شروع کنید. اگر کمتر باشد، توصیه می شود حجم را با آب فوق خالص به 100 میکرولیتر برسانید.
9. قبل از شستشوی محصول، دانه های مغناطیسی باید در دمای اتاق خشک شوند. خشکی ناکافی به راحتی باعث می شود که باقیمانده اتانول بر واکنش های بعدی تأثیر بگذارد. خشکی بیش از حد باعث ترک خوردن دانه های مغناطیسی و کاهش بازده تصفیه می شود. به طور معمول، خشک کردن در دمای اتاق به مدت 3-5 دقیقه کافی است تا دانه ها کاملا خشک شوند.
10. در صورت نیاز، نمونه‌های DNA خالص شده یا با اندازه انتخاب شده شستشو داده می‌شوند 0.1× بافر TE را می توان در دمای 4 درجه سانتی گراد به مدت 2-1 هفته یا در دمای 20- درجه سانتی گراد به مدت یک ماه نگهداری کرد.
5. تقویت کتابخانه
1. انجام یا عدم انجام تقویت کتابخانه بستگی به مقدار ورودی DNA، انواع آداپتورها، کاربردهای داده توالی و غیره دارد. در صورت استفاده از آداپتورهای جزئی، مرحله تقویت مورد نیاز است. هنگام استفاده از آداپتورهای تمام قد، اگر DNA ورودی کمتر از 200 نانوگرم باشد، توصیه می شود تقویت را انجام دهید. در غیر این صورت، تقویت لازم نیست.
2. اعداد چرخه تقویت باید به شدت کنترل شوند. تقویت ناکافی ممکن است به بازده کتابخانه پایین منجر شود. تقویت بیش از حد ممکن است باعث افزایش بایاس، خطاها، خواندن تکراری و محصولات کایمریک شود. جدول 3 اعداد چرخه توصیه شده را با هدف قرار دادن بازده کتابخانه 1 میکروگرم فهرست می کند.
جدول 3 تعداد چرخه های توصیه شده برای تولید 1000 نانوگرم بازده کتابخانه
| DNA ورودی | تعداد چرخه های مورد نیاز برای تولید 1 میکروگرم بازده کتابخانه |
| 1000-2000 ng | 2 - 4 |
| 500 نانوگرم | 2 - 4 |
| 250 نانوگرم | 4 - 6 |
| 100 نانوگرم | 5 - 7 |
| 50 نانوگرم | 7 - 9 |
| 10 نانوگرم | 9 - 11 |
| 5 نانوگرم | 10 - 12 |
| 1 نانوگرم | 12 - 15 |
| 100 صفحه | 16 - 18 |
توجه داشته باشید
1. جدول 3 تعداد پارامترهای حلقه را با استفاده از تست‌های DNA ورودی با کیفیت بالا در حدود 200 جفت باز نشان می‌دهد. کیفیت DNA FFPE بسیار متفاوت است، و زمانی که کیفیت DNA ضعیف یا طول کتابخانه طولانی است، تعداد چرخه‌ها باید به طور مناسب افزایش یابد تا کتابخانه‌های کافی به دست آید.
2. اگر انتخاب اندازه در طول فرآیند ساخت کتابخانه مورد نیاز باشد، تعداد چرخه بالاتر برای تقویت کتابخانه توصیه می شود. در غیر این صورت، تعداد چرخه کمتر توصیه می شود.
3. در صورت استفاده از آداپتورهای ناقص، حداقل 2 سیکل باید تقویت شود تا یک آداپتور کامل تشکیل شود.
6. تجزیه و تحلیل کیفیت کتابخانه
1. کیفیت کتابخانه های ساخته شده به طور کلی با اندازه گیری غلظت و توزیع اندازه تجزیه و تحلیل می شود.
2. غلظت کتابخانه ها را می توان با روش های مبتنی بر فلورسنت مانند Qubit و PicoGreen یا qPCR اندازه گیری کرد.
3. استفاده از روش های کمی سازی مبتنی بر جذب مانند NanoDrop توصیه نمی شود.
4. توصیه می شود از روش qPCR برای کمی سازی کتابخانه استفاده کنید: روش های مبتنی بر فلورسنت مانند Qubit و PicoGreen نمی توانند ساختارهای ناقص dsDNA (درج های بدون آداپتور یا تنها با یکی از انتهای متصل شده با آداپتور) از کتابخانه های کامل متمایز شوند. روش qPCR تنها کتابخانه‌های کامل را با هر دو سر متصل شده با آداپتورها (کتابخانه‌های متوالی) تقویت و اندازه‌گیری می‌کند، بنابراین اندازه‌گیری دقیق‌تری برای بارگذاری فراهم می‌کند.
5. توزیع اندازه کتابخانه ها را می توان با استفاده از Agilent Bioanalyzer یا دستگاه های دیگر بر اساس اصول الکتروفورز مویرگی یا میکروسیال تجزیه و تحلیل کرد.
7. سایر مواد
1. دانه های مغناطیسی خالص سازی DNA: Hieff NGSTM دانه های انتخاب DNA (Yeasen Cat#12601) یا AMPure® XP Beads (A63880) یا سایر محصولات مشابه.
2.آداپتورها: آداپتور کامل برای Illumina: Yeasen Cat#13519-13520; 384 Dual CDI Primer: Yeasen Cat#12412~Cat#12413; 384 پرایمر با شاخص دوگانه (UDI): Yeasen Cat#12312~Cat#12315; آداپتورهای UMI UDI: Yeasen گربه#13370~گربه#13371; آداپتور کامل برای MGI: Yeasen Cat#13360-13362. مخلوط پرایمر DNA：گربه شماره 12190 یا گربه شماره 12191.
3. تجزیه و تحلیل کیفیت کتابخانه: Agilent 2100 Bioanalyzer DNA 1000 Chip/ Chip با حساسیت بالا یا سایر محصولات مشابه. معرف های کمی کتابخانه ای
4. سایر مواد: اتانول مطلق، آب فوق خالص استریل، نوک پیپت با احتباس کم، لوله PCR، پایه های مغناطیسی، چرخه حرارتی و غیره.
8. گردش کار
شکل 1. گردش کار از OnePot حرفه ای DNA کیت آماده سازی کتابخانه
ارقام
اندازه قطعات درج به دست آمده تحت شرایط قطعه قطعه شدن مختلف
با استفاده از 500 نانوگرم gDNA استاندارد به عنوان الگو، کتابخانه هایی با این کیت ساخته شد. شرایط قطعه قطعه شدن هضم آنزیمی در دمای 32 درجه سانتی گراد، 35 درجه سانتی گراد و 37 درجه سانتی گراد به ترتیب به مدت 5، 10، 15، 20 و 30 دقیقه بود. محصولات تکه تکه شده با دانه های مغناطیسی 1.2 برابر خالص شده و با 21 میکرولیتر ddH شسته شدند.2O. غلظت با استفاده از کیوبیت اندازه گیری شد و توزیع قطعات درج بازیابی شده در شکل زیر نشان داده شده است.
 |
شکل 2. پروفایل های کتابخانه در 32 درجه سانتی گراد برای زمان های مختلف هضم آنزیم
 |
 |
پرداخت و امنیت
اطلاعات پرداخت شما با اطمینان پردازش می شود. ما جزئیات کارت اعتباری را ذخیره نمی کنیم و به اطلاعات کارت اعتباری شما دسترسی نداریم.
تحقیق
شما همچنین ممکن است دوست داشته باشید
پرسش
این محصول فقط برای اهداف تحقیقاتی است و برای استفاده درمانی یا تشخیصی در انسان یا حیوانات در نظر گرفته نشده است. محصولات و محتوا توسط پتنت ها، علائم تجاری، و حق چاپ متعلق به Yeasen Biotechnology محافظت می شوند. نمادهای علامت تجاری نشان دهنده کشور مبدا هستند، نه لزوما ثبت در همه مناطق.
برخی از برنامه‌های کاربردی ممکن است به حقوق مالکیت معنوی شخص ثالث دیگری نیاز داشته باشند.
Yeasen به علم اخلاق اختصاص داده شده است و معتقد است که تحقیقات ما باید به سؤالات مهم و در عین حال اطمینان از ایمنی و استانداردهای اخلاقی بپردازد.