توضیحات محصول

کیت آماده سازی کتابخانه RNA دو حالته Hieff NGS™ Ultima یک کیت ساخت کتابخانه توالی یابی کل RNA برای پلتفرم توالی یابی Illumina® و MGI® است، از جمله معرف های تکه تکه شدن RNA، معرف های رونویسی معکوس، ds-cDNA متداول و خاص، و reagent های سنتز کتابخانه ای. کتابخانه توالی یابی را می توان به دنبال کیت خالص سازی mRNA یا کیت حذف rRNA ساخت. ماژول سنتز دو رشته ای مجهز به دو بافر است تا نیاز به یک کتابخانه معمولی یا کتابخانه مخصوص رشته را برآورده کند. در میان آنها، dTTP با dUTP در بافر سنتز دو رشته ای خاص جایگزین می شود، بنابراین dUTP می تواند به رشته دوم cDNA اضافه شود. DNA پلیمراز با وفاداری بالا به کار رفته در این کیت نمی تواند الگوی DNA حاوی اوراسیل را تقویت کند و به ویژگی رشته دست یابد. تمام معرف های ارائه شده تحت کنترل کیفیت دقیق و تأیید عملکرد قرار گرفته اند و از پایداری و تکرارپذیری ساخت کتابخانه تا حد زیادی اطمینان حاصل می کنند.

جریان کار

اجزای محصول

توجه: این کیت با هر دو پلتفرم Illumina و MGI سازگار است، اما Illumina اضافی یا MGI مخلوط پرایمر ( Cat# 13335 Primer Mix for Illumina و Cat# 13334 Primer Mix for MGI ) است مورد نیاز است.

حمل و نقل و ذخیره سازی

اجزای کیت آماده سازی کتابخانه mRNA دو حالته Hieff NGS™ Ultima در جعبه I همراه با کیسه های یخ ارسال می شوند و می توانند به مدت یک سال در دمای 2 تا 8 درجه سانتیگراد نگهداری شوند.
اجزای کیت آماده سازی کتابخانه mRNA دو حالته Hieff NGS™ Ultima در جعبه II با یخ خشک ارسال می شوند و می توانند به مدت یک سال در دمای -20 درجه سانتی گراد نگهداری شوند.

هشدارها

1 عملیات
1.1 برای ایمنی و سلامتی خود، لطفاً هنگام کار با این محصول از تجهیزات حفاظت فردی (PPE) مانند روپوش آزمایشگاهی و دستکش یکبار مصرف استفاده کنید. این محصول فقط برای استفاده تحقیقاتی است!
1.2 اجزاء را در دمای اتاق ذوب کنید. با چند بار بالا و پایین کردن، کاملاً مخلوط کنید، کمی به پایین بچرخانید و برای استفاده روی یخ قرار دهید.
1.3 توصیه می شود هر واکنش مرحله ای را در یک سیکلر حرارتی با درب گرم شده انجام دهید. سیکلر حرارتی باید قبل از استفاده تا دمای تنظیم شده گرم شود.
1.4 لوازم عاری از آلودگی RNase و تمیز کردن منطقه آزمایشی به طور منظم ضروری است.
1.5 عملیات نادرست ممکن است به احتمال زیاد باعث آلودگی آئروسل شود و بر دقت نتیجه تأثیر بگذارد. جداسازی فیزیکی اجباری مناطق اختلاط واکنش PCR و نواحی سنجش تصفیه محصول PCR توصیه می شود. مجهز به تجهیزاتی مانند پیپت های تخصصی برای ساخت کتابخانه.
2 اتصال آداپتور
2.1 کیت‌های آداپتور بلند Illumina یا MGI (آداپتور بارکد) و کیت‌های آداپتور کوتاه برای مشتریان در دسترس هستند تا با توجه به نیازهای آزمایشی خود از بین آنها انتخاب کنند.
2.2 انتخاب آداپتورهای تجاری با کیفیت بالا توصیه شد. در صورت انتخاب آداپتورهای خودساخته، لطفاً به یک شرکت با تجربه در سنتز پرایمر NGS اعتماد کنید و در مورد نیاز به کنترل دقیق آلودگی توجه کنید. علاوه بر این، توصیه می شود محلول آنیل DNA را در یک نیمکت تمیز تهیه کنید و هر بار فقط یک نوع آداپتور را برای جلوگیری از آلودگی متقاطع کار کنید.
2.3 لطفاً آداپتورها را روی یخ یا در دمای 4 درجه سانتیگراد ذوب کنید. هنگام کار در دمای اتاق، دمای آزمایشگاه نباید از 25 درجه سانتیگراد تجاوز کند تا از دناتوره شدن آداپتورها جلوگیری شود.
2.4 غلظت آداپتور مستقیماً بر راندمان بستن و بازده کتابخانه تأثیر می گذارد. حجم آداپتور اضافه شده به کیت به 5 میکرولیتر ثابت می شود. توصیه می شود آداپتورها با بافر 0.1×TE رقیق شوند و آداپتورهای رقیق شده را می توان به مدت 48 ساعت در دمای 4 درجه سانتی گراد نگهداری کرد. جدول 1 مقدار آداپتور توصیه شده برای مقادیر مختلف RNA ورودی را فهرست می کند.

جدول 1-1 مقدار آداپتور Illumina توصیه شده برای RNA ورودی مختلف

جدول 1-2 مقدار آداپتور MGI® توصیه شده برای RNA ورودی مختلف

*استفاده از آداپتور را می توان با توجه به انواع مختلف نمونه های RNA کل و مقدار ورودی تنظیم کرد.

3 تقویت کتابخانه

3.1 بر اساس نسل اول DNA پلیمراز، DNA پلیمراز با وفاداری بالا در کیت یکنواختی تقویت آن را بسیار بهبود بخشیده است و هیچ سوگیری تقویتی را نشان نمی دهد.
3.2 اگر آداپتور Indexed (همچنین به عنوان آداپتور بلند یا آداپتور Y بزرگ شناخته می شود) به DNA هدف متصل شود، می توان از مخلوط آغازگر ارائه شده در این کیت برای تقویت استفاده کرد. اگر از یک "آداپتور کوتاه" یا "آداپتور Y کوچک" برای بستن DNA استفاده شود، پرایمرهای شاخص برای تقویت مورد نیاز است.
3.3 اعداد چرخه تقویت باید به شدت کنترل شوند. تقویت ناکافی ممکن است به بازده کتابخانه پایین منجر شود. تقویت بیش از حد ممکن است باعث افزایش بایاس، خطا، خواندن تکراری، محصولات کایمریک و تجمع جهش‌های بسط شود. جدول 2 اعداد سیکل توصیه شده برای تقویت PCR را فهرست می کند.

جدول 2 تعداد چرخه های توصیه شده برای تولید کتابخانه RNA*

توجه: *بازده کتابخانه تنها به مقدار ورودی و تعداد چرخه های تقویت مربوط نمی شود. بلکه تحت تأثیر کیفیت نمونه ها، شرایط قطعه قطعه شدن و شرایط مرتب سازی قرار می گیرد. در فرآیند ساخت کتابخانه، مناسب ترین شرایط را با توجه به وضعیت واقعی انتخاب کنید.

4 پاکسازی DNA و انتخاب اندازه مبتنی بر مهره

4.1 مراحل متعددی در فرآیند ساخت کتابخانه وجود دارد که به دانه های مغناطیسی خالص سازی DNA نیاز دارد. ما دانه‌های انتخاب DNA Hieff NGS™ (Yeasen Cat#12601) یا دانه‌های مغناطیسی AMPure® XP (Beckman Cat#A63880) را برای خالص‌سازی DNA و انتخاب اندازه توصیه می‌کنیم.
4.2 دانه های مغناطیسی باید قبل از استفاده در دمای اتاق متعادل شوند، در غیر این صورت بازده کاهش می یابد و اثر انتخاب اندازه تحت تأثیر قرار می گیرد.
4.3 دانه های مغناطیسی باید قبل از استفاده با گرداب یا پیپت به خوبی مخلوط شوند.
4.4 هنگام انتقال مایع رویی، دانه ها را آسپیره نکنید، حتی مقادیر کمی از دانه ها ممکن است بر واکنش های زیر تأثیر بگذارد.
4.5 اتانول 80% باید تازه تهیه شود، در غیر این صورت بر راندمان بازیابی تأثیر می گذارد.
4.6 دانه های مغناطیسی باید قبل از شستشوی محصول در دمای اتاق خشک شوند. خشکی ناکافی به راحتی باعث می شود که باقیمانده اتانول بر واکنش های بعدی تأثیر بگذارد. خشکی بیش از حد باعث ترک خوردن دانه های مغناطیسی و کاهش بازده تصفیه می شود. به طور معمول، خشک کردن در دمای اتاق به مدت 3-5 دقیقه کافی است تا دانه ها کاملا خشک شوند.
4.7 در صورت نیاز، نمونه های DNA خالص شده یا انتخاب شده با اندازه شسته شده در بافر TE را می توان در دمای 4 درجه سانتی گراد به مدت 2-1 هفته یا در دمای 20- درجه سانتی گراد به مدت یک ماه نگهداری کرد.
5 تجزیه و تحلیل کیفیت کتابخانه
5.1 به طور معمول، کیفیت کتابخانه ساخته شده را می توان با توزیع طول و تشخیص غلظت ارزیابی کرد.
5.2 تشخیص غلظت کتابخانه: روش های مبتنی بر رنگ های فلورسنت DNA دو رشته ای، مانند Qubit®، PicoGreen®، و غیره. کمیت مطلق بر اساس qPCR.
5.3 روش های مبتنی بر تشخیص طیفی، مانند NanoDrop®، و غیره، برای تشخیص غلظت کتابخانه قابل استفاده نیستند.
5.4 qPCR برای تشخیص غلظت کتابخانه توصیه می‌شود: از طریق Qubit®، PicoGreen® و سایر روش‌های مبتنی بر رنگ‌های فلورسنت DNA دو رشته‌ای، نمی‌تواند به‌طور مؤثری بین محصولات متصل به آداپتورها در یک انتها، محصولات متصل نشده به آداپتورها در دو انتها و سایر محصولات ناقص دو رشته‌ای تمایز قائل شود. تعیین کمیت مطلق qPCR بر اساس اصل تقویت PCR است که فقط کتابخانه کامل آداپتور را در هر دو انتهای نمونه (کتابخانه ای که می توان توالی یابی کرد) اندازه گیری می کند، به استثنای تداخل کتابخانه های غیر توالی که به آداپتور در دو انتهای یک یا دو سر متصل نشده اند.
5.5 تشخیص توزیع طول کتابخانه می تواند توسط Agilent Bioanalyzer 2100 و سایر تجهیزات بر اساس اصل الکتروفورز مویرگی یا میکروسیال انجام شود.

اسناد:

برگه اطلاعات ایمنی

12308-COMPONENT A-MSDS-HB22803.pdf

12308-COMPONENT B-MSDS-HB220803.pdf

12308-COMPONENT C-MSDS-HB220803.pdf

12308-COMPONENT D-MSDS-HB220803.pdf

12308-COMPONENT E-MSDS-HB220803.pdf

12308-COMPONENT F-MSDS-HB220803.pdf

12308-COMPONENT G-MSDS-HB220803.pdf

12308-COMPONENT H-MSDS-HB220803.pdf

12308-COMPONENT I-MSDS-HB220803.pdf

12308-COMPONENT K-MSDS-HB220803.pdf

دفترچه راهنما

12308ES-Hieff NGS™ Ultima Dual-Mode RNA Library Prep Kit-Ver.EN20230327.pdf

استنادها و مراجع:

[1] رمزگشایی میکروبیوم روده کپور علفزار از طریق رویکرد چند omics
M Li، H Liang، H Yang، Q Ding، R Xia، J Chen، W Zhou… - Microbiome، 2024 IF:19.4

[2] غربالگری CRISPR ادغام شده، P-Bodies را به عنوان سرکوب کننده های انتقال اپیتلیال-مزانشیمی سرطان شناسایی می کند.
L Fang، L Zhang، M Wang، Y He، J Yang، Z Huang… - تحقیقات سرطان، 2024 IF: 12.7

[3] پپتید 1 مشتق از کلوتو با بازگرداندن بیان کلوتو از طریق تنظیم پس از رونویسی، پیری سلولی در کلیه فیبروتیک را مهار می‌کند.
X Zhang، L Li، H Tan، X Hong، Q Yuan، FF Hou… - Theranostics، 2024 IF: 12.4

[4] سلول های بنیادی با پوشش جزئی اسکلت بیرونی برای ترمیم میوکارد انفارکتوس شده
H He، Y Yuan، Y Wu، J Lu، X Yang، K Lu… - مواد پیشرفته، 2023 IF: 29.4

[5] نوآوری ژنومی و سیم کشی مجدد نظارتی در طول تکامل جنس پنبه Gossypium
M Wang، J Li، Z Qi، Y Long، L Pei، X Huang… - Nature Genetics، 2022 IF: 41.379

[6] آلل های خطر MTMR3 ایمنی IgA ناشی از گیرنده 9 مشابه را در نفروپاتی IgA افزایش می دهند.
Y Wang، T Gan، S Qu، L Xu، Y Hu، L Liu، S Shi، J Lv… - Kidney International، 2023 IF:19.6

[7] مکمل ویرایشگرهای پایه را تقسیم کنید تا ویرایش های خارج از هدف را به حداقل برسانید
X Xiong، K Liu، Z Li، FN Xia، XM Ruan، X He، JF Li - Nature Plants، 2023 IF:18.6

[8] وزیکول‌های مهندسی شده غشای خارجی باکتریایی که آدنوویروس‌های انکولیتیک را در خود محصور می‌کنند، با افزایش اتوفاژی سلول‌های تومور، کارایی ویروس‌درمانی سرطان را افزایش می‌دهند.
W Ban، M Sun، H Huang، W Huang، S Pan… - Nature Communications، 2023 IF:16.6

[9] مقاومت سلول‌های سرطانی در برابر IFNγ می‌تواند از طریق افزایش فعالیت مسیر ترمیم شکستگی دو رشته‌ای رخ دهد.
T Han، X Wang، S Shi، W Zhang، J Wang، Q Wu… - تحقیقات ایمونولوژی سرطان، 2023 IF: 12.0

[10] درمان ترکیبی مبتنی بر سیستم نانو تحویل بیومیمتیک دو هدف برای غلبه بر مقاومت سیس پلاتین در سرطان کبد
Y Huang، Q Kou، Y Su، L Lu، X Li، H Jiang… - مجله نانوبیوتکنولوژی، 2023 IF: 10.9

[11] PIAS3 با تنظیم TXNIP از طریق مسیر سیگنالینگ TGF-β در کارسینوم سلولی کبدی فروپتوز را ترویج می کند.
W Bao، J Wang، K Fan، Y Gao، J Chen - تحقیقات فارماکولوژیک، 2023 IF: 9.3

[12] شناسایی اهداف پروتئین متصل شونده به RNA با HyperTRIBE در ساکارومایسس سرویزیه
W Piao، C Li، P Sun، M Yang، Y Ding، W Song… - مجله بین المللی علوم مولکولی، 2023 IF: 5.6

[13] میکروبیوتا انتقال چرخه زندگی و دینامیک نماتوسیت را در چتر دریایی تنظیم می کند.
S Peng، L Ye، Y Li، F Wang، T Sun، L Wang، W Hao… - علم، 2023 IF: 5.08

[14] نمایه‌های رونوشت و miRNA شبکه تنظیم‌کننده و تنظیم‌کننده‌های کلیدی تشکیل آوند چوبی ثانویه در صنوبر "84K" را آشکار می‌کنند.
H Wang، P Zhao، Y He، Y Su، X Zhou… - مجله بین المللی علوم مولکولی، 2023 IF: 5.6