هیف NGS^TM کیت آماده سازی کتابخانه RNA EvoMax (dUTP) یک است پیش مخلوط شده، اکتینومایسین D رایگان و رشته خاص کل کتابخانه توالی یابی RNA آماده سازی کیت سازگار با پلتفرم های Illumina و MGI. این محصول در دو نوع موجود می باشد: لوله یا کیت آب بندی و این کیت بیشتر است راحت چه توسط دستگاه خودکار انتقال مایعات یا دستکاری دستی . این کیت حاوی معرف های تکه تکه شدن RNA، معرف های رونویسی معکوس، معرف های سنتز ds-cDNA رشته ای و معرف های تقویت کتابخانه ای است. می توان آن را با کیت خالص سازی mRNA یا کیت حذف rRNA مرتبط کرد تحقیقات mRNA یا lncRNA را انجام دهید. این محصول ماژول رونویسی معکوس را برای به دست آوردن کتابخانه ای با ویژگی زنجیره بالا بدون اکتینومایسین D بهینه می کند، که ایمنی آزمایش کنندگان را تا حد زیادی تضمین می کند. همه معرفها تحت کنترل کیفیت دقیق و اعتبارسنجی عملکردی قرار گرفتند تا پایداری و تکرارپذیری کتابخانه به حداکثر برسد. آماده سازی

مشخصات

اجزاء

توجه: * علامت نشان می دهد که جزء در کیت گنجانده نشده است. در صورت استفاده از آداپتورهای کامل، مخلوط پرایمر مورد نیاز است، در غیر این صورت چنین نیست'تی این کیت با پلتفرم های Illumina و MGI سازگار است، اما به مخلوط پرایمر اضافی نیاز دارد (Cat # 13334 Primer Mix for MGI^TM و Cat # 13335 Primer Mix for Illumina®) برای پلت فرم Illumina® یا MGI در صورت استفاده از آداپتورهای کامل.

شکل

طرح بندی گروه معرف صفحه ای.

شکل 1: طرح معرف کیت کتابخانه مهر و موم صفحه

شکل 2. اجزای ساده کیت آماده سازی کتابخانه EvoMax RNA.

ذخیره سازی

این محصول باید در دمای -25 تا 15 درجه سانتیگراد نگهداری شود 1 سال

دستورالعمل ها

1. مقدار توصیه شده برای اضافه کردن در یک سیستم 20 میکرولیتری است 0.1-1 واحدها (U) و مقدار ورودی را می توان بر اساس نتایج واقعی تنظیم کرد.

2. با توجه به نیازهای آزمایش، غلظت نهایی dUTP را می توان بین 0.2 تا 0.6 میلی مولار تنظیم کرد و 0.2 میلی مولار dTTP را می توان انتخابی اضافه کرد.

3. زمان واکنش در 25 ~ 37 ℃ می توان در عرض 5 تا 10 دقیقه با توجه به نیاز تجربی تنظیم کرد.

یادداشت ها

1. عملیات

1) لطفا با روپوش آزمایشگاهی و دستکش یکبار مصرف کار کنید،برای امنیت شما.

2) اجزاء را در دمای اتاق ذوب کنید. با چند بار بالا و پایین کردن، کاملاً مخلوط کنید، کمی به پایین بچرخانید و برای استفاده روی یخ قرار دهید.

3) توصیه می شود هر مرحله واکنش را در یک سیکلر حرارتی با درب گرم شده انجام دهید. سیکلر حرارتی باید قبل از استفاده تا دمای تنظیم شده گرم شود.

4) لوازم عاری از آلودگی RNase و تمیز کردن منطقه آزمایشی به طور منظم ضروری است. RNAZap ThermoFisher^TM اسپری حذف اسید نوکلئیک با کارایی بالا برای حذف آلودگی RNase توصیه شد.

5) عملیات نامناسب ممکن است به احتمال زیاد باعث آلودگی آئروسل شود که بر دقت نتیجه تأثیر می گذارد. جداسازی فیزیکی اجباری مناطق اختلاط واکنش PCR و نواحی سنجش تصفیه محصول PCR توصیه می شود. مجهز به تجهیزاتی مانند پیپت های تخصصی برای ساخت کتابخانه.

6) این معرف برای یک بار مصرف می باشد. استفاده چندگانه اکیدا ممنوع است.

7) این محصول فقط برای استفاده تحقیقاتی است.

2. اتصال آداپتور

1) کیت‌های آداپتور بلند Illumina یا MGI (آداپتور بارکد) و کیت‌های آداپتور کوتاه برای مشتریان در دسترس هستند تا با توجه به نیازهای آزمایشی خود انتخاب کنند.

2) انتخاب آداپتورهای تجاری با کیفیت بالا توصیه شد. اگر آداپتورهای خودساخته انتخاب شده‌اند، لطفاً به یک شرکت با تجربه در سنتز پرایمر NGS اعتماد کنید و به نیاز به کنترل دقیق آلودگی توجه کنید. علاوه بر این، توصیه می شود محلول آنیل DNA را در یک نیمکت تمیز تهیه کنید و هر بار فقط یک نوع آداپتور را برای جلوگیری از آلودگی متقاطع کار کنید.

3) لطفاً آداپتورها را روی یخ یا در دمای 4 درجه سانتیگراد ذوب کنید. هنگام کار در دمای اتاق، دمای آزمایشگاه نباید از 25 درجه سانتیگراد تجاوز کند تا از دناتوره شدن آداپتورها جلوگیری شود.

4) غلظت آداپتور مستقیماً بر راندمان بستن و بازده کتابخانه تأثیر می گذارد. حجم آداپتور اضافه شده به کیت به 5 میکرولیتر ثابت می شود. توصیه می شود آداپتورها با بافر 0.1×TE رقیق شوند و آداپتورهای رقیق شده را می توان به مدت 48 ساعت در دمای 4 درجه سانتی گراد نگهداری کرد. جدول 1 مقدار آداپتور توصیه شده برای مقادیر مختلف RNA ورودی را فهرست می کند.

جدول 1-1 مقدار آداپتور Illumina توصیه شده برای RNA ورودی مختلف

جدول 1-2 مقدار آداپتور MGI توصیه شده برای RNA ورودی مختلف

* استفاده از آداپتور را می توان با توجه به انواع مختلف نمونه های RNA کل و مقدار ورودی تنظیم کرد

3.تقویت کتابخانه

1) بر اساس DNA پلیمراز نسل اول، DNA پلیمراز با وفاداری بالا در کیت یکنواختی تقویت آن را بسیار بهبود بخشیده است و هیچ سوگیری تقویتی را نشان نمی دهد.

2) اعداد چرخه تقویت باید به شدت کنترل شوند. تقویت ناکافی ممکن است به بازده کتابخانه پایین منجر شود. تقویت بیش از حد ممکن است باعث افزایش بایاس، خطا، خواندن تکراری، محصولات کایمریک و تجمع جهش‌های گسترش شود. جدول 2 اعداد سیکل توصیه شده برای تقویت PCR را فهرست می کند.

3) تعداد چرخه های توصیه شده توصیه شده در جدول 2 می تواند اکثریت قریب به اتفاق نیازهای آماده سازی کتابخانه را برآورده کند. اگر نمونه شما از کیفیت پایینی برخوردار است (مانند نمونه‌های FFPE با تخریب شدید)، می‌توان تعداد چرخه‌ها را با توجه به وضعیت واقعی به طور مناسب افزایش داد. توجه داشته باشید که mRNA در گونه‌ها و بافت‌های مختلف متفاوت است، تعداد چرخه‌های تقویت باید تنظیم شود.

جدول 2 ورودی حجم کل RNA و چرخه های تقویت توصیه شده جدول *

[توجه]: *بازده کتابخانه نه تنها به کمیت ورودی و تعداد چرخه های تقویت مربوط می شود، بلکه تحت تأثیر کیفیت نمونه ها، شرایط قطعه قطعه شدن و شرایط مرتب سازی نیز قرار دارد. در فرآیند ساخت کتابخانه، مناسب ترین شرایط را با توجه به وضعیت واقعی انتخاب کنید.

4. پاکسازی DNA و انتخاب اندازه مبتنی بر مهره

1) مراحل متعددی در فرآیند ساخت کتابخانه وجود دارد که به دانه های مغناطیسی خالص سازی DNA نیاز دارد. ما دانه‌های انتخاب DNA Hieff NGS™ (Yeasen Cat#12601) یا دانه‌های مغناطیسی AMPure® XP (Beckman Cat#A63880) را برای خالص‌سازی DNA و انتخاب اندازه توصیه می‌کنیم.

2) مهره مغناطیسی باید قبل از استفاده در دمای اتاق متعادل شود، در غیر این صورت بازده کاهش می یابد و اثر انتخاب اندازه تحت تأثیر قرار می گیرد.

3) دانه های مغناطیسی باید قبل از استفاده با گرداب یا پیپت به خوبی مخلوط شوند.

4) هنگام انتقال مایع رویی، دانه ها را آسپیره نکنید، حتی مقادیر کمی از دانه ها ممکن است بر واکنش های زیر تأثیر بگذارد.

5) اتانول 80% باید تازه تهیه شود، در غیر این صورت بر راندمان بازیابی تأثیر می گذارد.

6) قبل از شستشوی محصول، دانه های مغناطیسی باید در دمای اتاق خشک شوند. خشکی ناکافی به راحتی باعث می شود که باقیمانده اتانول بر واکنش های بعدی تأثیر بگذارد. خشکی بیش از حد باعث ترک خوردن دانه های مغناطیسی و کاهش بازده تصفیه می شود. به طور معمول، خشک کردن در دمای اتاق به مدت 3-5 دقیقه کافی است تا دانه ها کاملا خشک شوند.

7) در صورت نیاز، نمونه‌های DNA خالص یا انتخاب‌شده با اندازه شسته شده در بافر TE را می‌توان در دمای 4 درجه سانتی‌گراد به مدت 1-2 هفته یا در دمای 20- درجه سانتی‌گراد به مدت یک ماه نگهداری کرد.

5.تجزیه و تحلیل کیفیت کتابخانه

به طور کلی، کیفیت کتابخانه ساخته شده را می توان با تشخیص غلظت و تشخیص توزیع طول ارزیابی کرد.

6. مواد دیگر

1) کیت غنی‌سازی mRNA: Hieff NGS® mRNA Isolation Master Kit V2 (Yeasen Cat # 12629).

2) کیت حذف rRNA: کیت حذف rRNA انسانی Hieff NGS® MaxUp (rRNA & ITS / ETS) (Yeasen Cat # 12257) یا کیت حذف rRNA دیگر.

3) خالص سازی RNA دانه های مغناطیسی: پاک کننده RNA Hieff NGS® (Yeasen Cat # 12602) یا سایر محصولات مشابه.

4) دانه های مغناطیسی خالص شده با DNA: دانه های انتخابی DNA Hieff NGS® (Yeasen Cat # 12601) یا AMPure® XP Beads (A63880) یا سایر محصولات مشابه.

5) کنترل کیفیت RNA: Agilent 2100 Bioanalyzer RNA 6000 Nano / Pico Chip یا سایر محصولات مشابه.

6) آداپتورها: آداپتور کامل برای استفاده از Illumina® (Cat # 13519-13520 یا معادل دیگر) یا آداپتور کامل برای استفاده از MGI® (Cat # 13360-13362 یا معادل دیگر).

7. بازرسی کیفیت کتابخانه

Agilent 2100 Bioanalyzer DNA 1000 Chip / تراشه با حساسیت بالا یا سایر محصولات مشابه. معرف های کمی سازی کتابخانه ای

8. مواد دیگر

اتانول بدون آب، آب فوق خالص استریل، سر تفنگ با جذب کم، لوله PCR، قاب مغناطیسی، ابزار PCR و غیره.

نمودار جریان

شکل 1: فرآیند ساخت کتابخانه RNA

آماده سازی کتابخانه RNA برای نمونه های FFPE با کیفیت مختلف

برای RNA FFPE به شدت تخریب شده (DV 200 <50%) و نمونه های ورودی کم، ما یک پروتکل Double-purification پس از بستن آداپتور برای کاهش از دست دادن کتابخانه توصیه می کنیم.

الگوهای اوج نمونه های FFPE با کیفیت مختلف