شرح
Hieff NGS™ OnePot Pro DNA Library Prep Kit V4 یک کیت آماده سازی کتابخانه آنزیمی نسل بعدی است که برای استفاده با Illumina طراحی شده است. و پلتفرم های توالی یابی با توان بالای MGI. در مقایسه با روش‌های سنتی آماده‌سازی کتابخانه، این کیت از آنزیم‌های تکه تکه‌شدن با کیفیت بالا استفاده می‌کند و نیاز به فرآیندهای فراصوتی دست و پا گیر را از بین می‌برد. ماژول‌های تکه تکه شدن و تعمیر نهایی در یک مرحله ترکیب می‌شوند و به طور قابل توجهی زمان و هزینه آماده‌سازی کتابخانه را کاهش می‌دهند. این کیت برای طیف وسیعی از انواع نمونه، از جمله ژنوم گیاهی و حیوانی، ژنوم میکروبی و موارد دیگر، با محدوده ورودی نمونه 1 نانوگرم تا 1 میکروگرم مناسب است. تکه تکه شدن آنزیمی اندازه قطعات یکنواخت را در میان گونه های مختلف با حداقل تنوع بین گونه ای تضمین می کند. علاوه بر این، این کیت را می توان با Illumina جفت کرد یا MGI آداپتورها و پرایمرها برای توالی یابی در پلتفرم های پرتوان Illumina یا MGI.
مشخصات
| گربه شماره | 12972ES08 / 12972ES24 / 12972ES96 |
| اندازه | 8 T / 24 T / 96 تی |
اجزاء
| اجزای شماره | نام | 12972ES08 | 12972ES24 | 12972ES96 |
| 12972-الف | 80 μL | 240 μL | 960 μL | |
| 12972-ب | Smearase™ آنزیم 4.0 | 80 μL | 240 μL | 960 μL |
| 12972-سی | تقویت کننده بستن 4.0 | 240 میکرولیتر | 720 μL | 3×960 μL |
| 12972-دی | سریع DNA لیگاز 4.0 | 80 μL | 240 μL | 2×480 μL |
| 12972-ای | 2× میکس تقویت HF Ultima | 200 میکرولیتر | 600 μL | 3×800 میکرولیتر |
ذخیره سازی
این محصول باید در دمای -25 ~ -15 درجه سانتیگراد برای 1 نگهداری شود سال
یادداشت ها
1. در مورد عملیات
1. لطفا با کت آزمایشگاه و دستکش یکبار مصرف کار کنید،برای امنیت شما
2. اجزاء را در دمای اتاق ذوب کنید. پس از ذوب شدنبا چرخاندن کاملاً مخلوط کنید، لوله را به طور مختصر بچرخانید و برای استفاده بعدی روی یخ قرار دهید.
3. هنگام تهیه محلول واکنش هر مرحله، توصیه می شود از یک پیپت برای مخلوط کردن خوب یا تکان دادن ملایم استفاده کنید. تکان دادن شدید ممکن است باعث کاهش خروجی کتابخانه شود.
4. برای جلوگیری از آلودگی متقاطع، استفاده از نوک پیپت فیلتر شده به شدت توصیه می شود. هنگام پردازش نمونه های مختلف حتما نوک پیپت را عوض کنید.
5. عملیات نامناسب ممکن است به احتمال زیاد باعث آلودگی آئروسل شود و بر دقت نتیجه تأثیر بگذارد. جداسازی فیزیکی اجباری مناطق اختلاط واکنش PCR و نواحی سنجش تصفیه محصول PCR توصیه می شود. مجهز به تجهیزاتی مانند پیپت های تخصصی برای ساخت کتابخانه.با پاک کردن سطوح با 0.5% هیپوکلریت سدیم یا 10% سفید کننده، تمیز کردن معمولی را برای هر ناحیه انجام دهید.
6. این محصول فقط برای استفاده تحقیقاتی است.
2. تکه تکه شدن DNA1. این کیت با 100 pg سازگار است - 1000 نانوگرم DNA ورودی استفاده از DNA ورودی با کیفیت بالا با A260/A280 = 1.8-2.0 به شدت توصیه می شود.
2. آزمایش‌های زیر می‌توانند تحت تأثیر قرار گیرند اگر غلظت‌های بالایی از نمک‌ها مانند عامل کیلیت فلزی با DNA ورودی معرفی شوند. توصیه می کنیم نمونه DNA را در آن شستشو دهید ddH2O برای تکه تکه شدن
3. لطفا به جدول مراجعه کنید 6 برای زمان تکه تکه شدن نمونه های استاندارد DNA.این کیت دارای سوگیری تکه تکه شدن کم است و پوشش GC یکنواخت را برای نمونه های DNA با طیف گسترده ای از ترکیبات GC فراهم می کند. لطفاً زمان تکه تکه شدن را بر اساس نیازهای آزمایشی خود تنظیم کنید.
4. برای تکه تکه شدن دقیق، لطفا واکنش را روی یخ آماده کنید.
3. اتصال آداپتور
1. کیت‌های آداپتور بلند Illumina یا MGI (آداپتور بارکد) و کیت‌های آداپتور کوتاه برای مشتریان در دسترس هستند تا با توجه به نیازهای آزمایشی خود انتخاب کنند.
2. انتخاب آداپتورهای تجاری با کیفیت بالا توصیه شد. اگر آداپتورهای خودساخته انتخاب شده‌اند، لطفاً به یک شرکت با تجربه در سنتز پرایمر NGS اعتماد کنید و به نیاز به کنترل دقیق آلودگی توجه کنید. علاوه بر این، توصیه می شود محلول آنیل DNA را در یک نیمکت تمیز تهیه کنید و هر بار فقط یک نوع آداپتور را برای جلوگیری از آلودگی متقاطع کار کنید.
3. لطفاً آداپتورها را روی یخ یا در دمای 4 درجه سانتیگراد ذوب کنید. هنگام کار در دمای اتاق، دمای آزمایشگاه نباید از 25 درجه سانتیگراد تجاوز کند تا از دناتوره شدن آداپتورها جلوگیری شود.
4. کیفیت و غلظت آداپتورها مستقیماً بر راندمان بستن و بازده کتابخانه تأثیر می گذارد. غلظت بیش از حد آداپتورها به نفع تشکیل دایمر آداپتور است در حالی که آداپتور بسیار کم سرعت بستن و بازده کتابخانه را کاهش می دهد. رقت های مربوطه با بافر TE با توجه به مقدار DNA ورودی هنگام استفاده از آداپتور. جدول 2 -3 روش های پیشنهادی رقیق سازی آداپتور را برای مقادیر مختلف DNA ورودی با استفاده از این کیت فهرست می کند.
جدول 1 مقدار آداپتور Illumina توصیه شده برای DNA ورودی مختلف
| DNA ورودی | رقیق سازی آداپتور (حجم آداپتور: حجم کل) | تمرکز |
| 1 ng | 30-Fold (1: 30) | 0.5 μM |
| 10 ng | 7.5-Fold (1: 7.5) | 2 μM |
| 100 نانوگرم | 3-Fold (1: 3) | 5 μM |
| 1000 نانوگرم | 1.5-Fold (1: 1.5) | 10 μM |
جدول 2 مقدار آداپتور MGI توصیه شده برای DNA ورودی مختلف
| DNA ورودی | رقیق سازی آداپتور (حجم آداپتور: حجم کل) | تمرکز |
| 1 ng | 20-Fold (1: 20) | 0.5 μM |
| 10 ng | 5-Fold (1: 5) | 2 μM |
| 100 نانوگرم | 2-Fold (1: 2) | 5 μM |
| 1000 نانوگرم | رقیق نشده | 10 μM |
4. پاکسازی DNA و انتخاب اندازه مبتنی بر مهره
1. مرحله انتخاب اندازه قطعه DNA را می توان پس از بستن آداپتور یا پس از تقویت کتابخانه ای انجام داد.
2. اگر مقدار DNA ورودی بیش از 50 نانوگرم باشد، بلافاصله پس از بستن آداپتور، انتخاب اندازه توصیه می شود.; در غیر این صورت، لطفا انتخاب اندازه را پس از تقویت انجام دهید.
3. Ligation Enhancer حاوی غلظت بالایی از PEG است که ممکن است تأثیر قابل توجهی در انتخاب دقیق اندازه داشته باشد. بنابراین، اگر قرار است انتخاب اندازه درست بعد از بستن آداپتور انجام شود، اکیداً توصیه می‌شود که قبل از انتخاب اندازه، یک مرحله تمیز کردن دانه‌ها اضافه شود. مرحله انتخاب اندازه را می توان به طور مستقیم انجام داد اگر قبل از پایان تعمیر / dA-tailing یا بعد از آن انجام شود تقویت کتابخانه
4. دانه های مغناطیسی باید قبل از استفاده در دمای اتاق متعادل شوند، در غیر این صورت بازده کاهش می یابد و اثر انتخاب اندازه تحت تأثیر قرار می گیرد.
5. دانه های مغناطیسی باید قبل از استفاده با گرداب یا پیپت به خوبی مخلوط شوند.
6. هنگام انتقال مایع رویی، دانه ها را آسپیره نکنید، حتی مقادیر کمی از دانه ها ممکن است بر واکنش های زیر تأثیر بگذارد.
7. اتانول 80% باید تازه تهیه شود، در غیر این صورت بر راندمان بازیابی تأثیر می گذارد.
8. برای انتخاب دقیق اندازه، توصیه می شود با حجم بیش از 100 میکرولیتر شروع کنید. اگر کمتر باشد، توصیه می شود حجم را با آب فوق خالص به 100 میکرولیتر برسانید.
9. قبل از شستشوی محصول، دانه های مغناطیسی باید در دمای اتاق خشک شوند. خشکی ناکافی به راحتی باعث می شود که باقیمانده اتانول بر واکنش های بعدی تأثیر بگذارد. خشکی بیش از حد باعث ترک خوردن دانه های مغناطیسی و کاهش بازده تصفیه می شود. به طور معمول، خشک کردن در دمای اتاق به مدت 3-5 دقیقه کافی است تا دانه ها کاملا خشک شوند.
10. در صورت نیاز، نمونه‌های DNA خالص شده یا با اندازه انتخاب شده شستشو داده می‌شوند 0.1× بافر TE را می توان در دمای 4 درجه سانتی گراد به مدت 2-1 هفته یا در دمای 20- درجه سانتی گراد به مدت یک ماه نگهداری کرد.
5. تقویت کتابخانه
1. انجام یا عدم انجام تقویت کتابخانه بستگی به مقدار ورودی DNA، انواع آداپتورها، کاربردهای داده توالی و غیره دارد. در صورت استفاده از آداپتورهای جزئی، مرحله تقویت مورد نیاز است. هنگام استفاده از آداپتورهای تمام قد، اگر DNA ورودی کمتر از 200 نانوگرم باشد، توصیه می شود تقویت را انجام دهید. در غیر این صورت، تقویت لازم نیست.
2. اعداد چرخه تقویت باید به شدت کنترل شوند. تقویت ناکافی ممکن است به بازده کتابخانه پایین منجر شود. تقویت بیش از حد ممکن است باعث افزایش بایاس، خطاها، خواندن تکراری و محصولات کایمریک شود. جدول 3 اعداد چرخه توصیه شده را با هدف قرار دادن بازده کتابخانه 1 میکروگرم فهرست می کند.
جدول 3 تعداد چرخه های توصیه شده برای تولید 1000 نانوگرم بازده کتابخانه
| DNA ورودی | تعداد چرخه های مورد نیاز برای تولید 1 میکروگرم بازده کتابخانه |
| 1000 نانوگرم | 2 - 4 |
| 500 نانوگرم | 2 - 4 |
| 250 نانوگرم | 4 - 6 |
| 100 نانوگرم | 5 - 7 |
| 50 نانوگرم | 7 - 9 |
| 1 نانوگرم | 12 - 14 |
توجه داشته باشید：
1. جدول 3 تعداد پارامترهای حلقه را با استفاده از تست‌های DNA ورودی با کیفیت بالا در حدود 200 جفت باز نشان می‌دهد. کیفیت DNA FFPE بسیار متفاوت است، و زمانی که کیفیت DNA ضعیف یا طول کتابخانه طولانی است، تعداد چرخه‌ها باید به طور مناسب افزایش یابد تا کتابخانه‌های کافی به دست آید.
2.منانتخاب اندازه در طول فرآیند ساخت کتابخانه مورد نیاز است، تعداد چرخه بالاتر برای تقویت کتابخانه توصیه می شود. در غیر این صورت، تعداد چرخه کمتر توصیه می شود.
3.مناگر از آداپتورهای ناقص استفاده می شود، حداقل 2 سیکل باید تقویت شود تا یک آداپتور کامل تشکیل شود.
6. تجزیه و تحلیل کیفیت کتابخانه
1. کیفیت کتابخانه های ساخته شده به طور کلی با اندازه گیری غلظت و توزیع اندازه تجزیه و تحلیل می شود.
2. غلظت کتابخانه ها را می توان با روش های مبتنی بر فلورسنت مانند Qubit و PicoGreen یا qPCR اندازه گیری کرد.
3. استفاده از روش های کمی سازی مبتنی بر جذب مانند NanoDrop توصیه نمی شود.
4. توصیه می شود از روش qPCR برای کمی سازی کتابخانه استفاده کنید: روش های مبتنی بر فلورسنت مانند Qubit و PicoGreen نمی توانند ساختارهای ناقص dsDNA (درج های بدون آداپتور یا تنها با یکی از انتهای متصل شده با آداپتور) از کتابخانه های کامل متمایز شوند. روش qPCR تنها کتابخانه‌های کامل را با هر دو سر متصل شده با آداپتورها (کتابخانه‌های متوالی) تقویت و اندازه‌گیری می‌کند، بنابراین اندازه‌گیری دقیق‌تری برای بارگذاری فراهم می‌کند.
5. توزیع اندازه کتابخانه ها را می توان با استفاده از Agilent Bioanalyzer یا دستگاه های دیگر بر اساس اصول الکتروفورز مویرگی یا میکروسیال تجزیه و تحلیل کرد.
7. مواد دیگر
1. دانه های مغناطیسی خالص سازی DNA: Hieff NGSTM دانه های انتخاب DNA (Yeasen Cat#12601) یا AMPure® XP Beads (A63880) یا سایر محصولات مشابه.
2. آداپتورها: آداپتور کامل برای Illumina: Yeasen Cat#13519-13520; 384 پرایمر دوگانه CDI: یاسن Cat#12412~Cat#12413; 384 پرایمر با شاخص دوگانه (UDI): Yeasen گربه شماره 12327~گربه شماره 13330; آداپتورهای UMI UDI: یاسن Cat#13370~Cat#13371; آداپتور کامل برای MGI: Yeasen Cat#13360-13362. مخلوط پرایمر DNA：گربه#12190 یا گربه#12191.
3. تجزیه و تحلیل کیفیت کتابخانه: Agilent 2100 Bioanalyzer DNA 1000 Chip/ Chip با حساسیت بالا یا سایر محصولات مشابه. معرف های کمی کتابخانه ای
4. سایر مواد: اتانول مطلق، آب فوق خالص استریل، نوک پیپت با احتباس کم، لوله PCR، پایه های مغناطیسی، چرخه حرارتی و غیره.
8. گردش کار
شکل 1.گردش کار از OnePot حرفه ای DNA کیت آماده سازی کتابخانه
پرداخت و امنیت
اطلاعات پرداخت شما با اطمینان پردازش می شود. ما جزئیات کارت اعتباری را ذخیره نمی کنیم و به اطلاعات کارت اعتباری شما دسترسی نداریم.
تحقیق
شما همچنین ممکن است دوست داشته باشید
پرسش
این محصول فقط برای اهداف تحقیقاتی است و برای استفاده درمانی یا تشخیصی در انسان یا حیوانات در نظر گرفته نشده است. محصولات و محتوا توسط پتنت ها، علائم تجاری، و حق چاپ متعلق به Yeasen Biotechnology محافظت می شوند. نمادهای علامت تجاری نشان دهنده کشور مبدا هستند، نه لزوما ثبت در همه مناطق.
برخی از برنامه‌های کاربردی ممکن است به حقوق مالکیت معنوی شخص ثالث دیگری نیاز داشته باشند.
Yeasen به علم اخلاق اختصاص داده شده است و معتقد است که تحقیقات ما باید به سؤالات مهم و در عین حال اطمینان از ایمنی و استانداردهای اخلاقی بپردازد.