شرح
کیت شمارش سلولی-8 (CCK-8) یک کیت تشخیص سریع و بسیار حساس بر اساس معرف WST-8 (2-(2-متوکسی-4-نیتروفنیل)-3-(4-نیتروفنیل)-5-(2،4-دی سولفوفنیل)-2H-تترازولیوم مونوسدیم نمک) است. WST-8 یک معرف ارتقا یافته MTT است و می تواند توسط دهیدروژنازها در میتوکندری به فرمازان زرد نارنجی بسیار محلول در آب تبدیل شود. مقدار فرمازان تولید شده متناسب با تعداد سلول های زنده است. مقدار OD فورمازان در 450 نانومتر که توسط یک میکروپلیت خوان شناسایی می شود می تواند به طور غیر مستقیم تعداد سلول های زنده را نشان دهد. این کیت به طور گسترده برای غربالگری دارو، تکثیر سلولی و سنجش سمیت سلولی، تست حساسیت به داروی تومور و تشخیص فعالیت عوامل بیولوژیکی استفاده می شود.
مزایای روش CCK-8
1. مقایسه روش CCK-8 با سایر روشهای تشخیص تکثیر/سمیت سلولی.
روش تشخیص | روش MTT | روش XTT | روش WST - 1 | روش CCK 8 |
---|---|---|---|---|
حلالیت آب محصول فرمازان | کم (نیاز به اضافه کردن حلال آلی برای حل شدن و سپس آزمایش) | بالا | بالا | بالا |
ویژگی های محصول | پودر | 2 بطری محلول | راه حل | 1 بطری محلول |
روش استفاده | در محلول مخلوط کرده و استفاده کنید | محلول درست قبل از استفاده آماده شد. | خارج از جعبه | خارج از جعبه |
حساسیت تشخیص | بالا | خیلی بالا | خیلی بالا | بالا |
تشخیص زمان | طولانی | کوتاه | کوتاه | کوتاه ترین |
تشخیص طول موج | 560-600 نانومتر | 420-480 نانومتر | 420-480 نانومتر | 430-490 نانومتر |
سمیت سلولی | سمیت بالا، ناپدید شدن کامل مورفولوژی سلولی | سمیت کم، مورفولوژی سلولی بدون تغییر | کم سمیت، مورفولوژی سلول بدون تغییر | سمیت کم، مورفولوژی سلولی بدون تغییر |
پایداری معرف | ژنرال | کم | ژنرال | بالا |
تست نمونه انبوه | شدنی | مناسب | مناسب | مناسب |
2. فنل قرمز و سرم با تشخیص CCK-8 تداخلی ندارند.
3. از آنجایی که سمیت سلولی معرف CCK-8 بسیار کم است، زمان اندازه گیری بهینه را می توان با خواندن مکرر با میکروپلیت خوان در زمان های مختلف پس از افزودن معرف CCK-8 تعیین کرد.
حمل و نقل و ذخیره سازی
این محصول را می توان در دمای -25 تا 15 درجه سانتیگراد در جای خشک و تاریک به مدت دو سال نگهداری کرد.
موارد احتیاط
1. در آزمایش اول، تعیین تعداد بهینه سلول های اندود شده و زمان انکوباسیون بهینه معرف CCK-8 توصیه می شود.
2. در صورت امکان، از یک پیپت چند کاناله برای کاهش تغییرات بین چاه های تکراری استفاده کنید. از ایجاد حباب در آزمایش اجتناب کنید زیرا حباب ها در خواندن OD اختلال ایجاد می کنند. هنگام افزودن معرف CCK-8، توصیه می شود به جای قرار دادن آن در محیط کشت، آن را نزدیک دیواره صفحه کشت اضافه کنید.
3. گلبول های سفید ممکن است به زمان انکوباسیون طولانی تری نیاز داشته باشند.
4. هنگام استفاده از یک صفحه استاندارد 96 چاهی، تعداد سلول های آبکاری شده حداقل 1000 سلول در چاه (100 میکرولیتر) است. حساسیت تشخیص برای گلبول های سفید خون نسبتا پایین است، بنابراین توصیه می شود حداقل 2500 سلول در چاه (100 میکرولیتر) پلاک شود. در صورت استفاده از صفحه 24 چاهی یا 6 چاهی، تعداد سلول های مربوط به هر چاهک را محاسبه کرده و حجم مناسب معرف CCK-8 را اضافه کنید (حجم معرف CCK-8 اضافه شده 10 درصد حجم محیط کشت در هر چاهک پلیت است).
5.اگر فیلتر 450 نانومتری در دسترس نباشد، میتوان از فیلتری با جذب بین 430 تا 490 نانومتر استفاده کرد، اما فیلتر 450 نانومتری میتواند به بالاترین حساسیت تشخیص دست یابد.
6. فنل قرمز بر اندازه گیری تأثیر نمی گذارد زیرا جذب فنل قرمز در محیط را می توان با کم کردن جذب گروه خالی حذف کرد.
7. برای ایمنی و سلامتی خود، لطفاً هنگام اجرای آزمایش از روپوش آزمایشگاهی و دستکش یکبار مصرف استفاده کنید.
دستورالعمل ها
I. یک منحنی استاندارد ایجاد کنید
1. سوسپانسیون سلولی را آماده کنید، تراکم سلولی و سپس سلول های صفحه ای را تعیین کنید.
2. به طور متوالی سلول ها را با محیط کشت با توجه به نسبت معینی (مانند نسبت 1:2) رقیق کنید تا یک گرادیان غلظت سلولی، به طور کلی 3-5 گرادیان غلظت سلولی، 3-6 چاهک تکرار برای هر غلظت تشکیل شود.
3. پس از پوشش دهی، سلول ها را به مدت 2-4 ساعت کشت دهید تا چسبندگی پیدا کنند. سپس، معرف CCK-8 را اضافه کنید، برای مدت معینی انکوبه کنید و مقدار OD را اندازه گیری کنید. یک منحنی استاندارد با شماره سلول به عنوان محور X و مقدار OD به عنوان محور Y رسم کنید. با توجه به این منحنی استاندارد می توان تعداد سلول را در یک نمونه ناشناخته تعیین کرد (پیش فرض استفاده از این منحنی استاندارد این است که شرایط آزمایش باید سازگار باشد).
II. سنجش بقای سلولی
1. سلول ها (100 میکرولیتر در چاه) را در یک صفحه 96 چاهی قرار دهید. صفحه را در انکوباتور (37 درجه سانتیگراد، 5٪ CO) قرار دهید2) برای یک دوره زمانی برای قبل از جوجه کشی.
2. 10 میکرولیتر از معرف CCK-8 را به هر چاهک اضافه کنید (مراقب باشید حباب ها به چاه ها وارد نشود، زیرا با خواندن OD تداخل دارند) و به آرامی مخلوط کنید.
3. پلیت را در دستگاه جوجه کشی قرار دهید و 1-4 ساعت انکوبه کنید.
4. جذب را در 450 نانومتر با میکروپلیت خوان اندازه گیری کنید.
5. اگر مقدار OD بلافاصله اندازه گیری نشد، 10 میکرولیتر محلول HCl 0.1 مولار یا محلول 1% w/v SDS را به هر چاهک اضافه کنید، روی صفحه را بپوشانید و آن را با محافظت در برابر نور در دمای اتاق نگهداری کنید. مقدار جذب ظرف 24 ساعت تغییر نمی کند.
III. سنجش تکثیر سلولی و سمیت سلولی
1. سلول ها (100 میکرولیتر در چاه) را در یک صفحه 96 چاهی قرار دهید. صفحه را در انکوباتور (37 درجه سانتیگراد، 5٪ CO) قرار دهید2) به مدت 24 ساعت برای پیش جوجه کشی.
2. 10 میکرولیتر از غلظت های مختلف ماده مورد آزمایش را به صفحه اضافه کنید.
3. پلیت را در انکوباتور قرار دهید و برای مدت معینی (مانند 6، 12، 24 یا 48 ساعت) انکوبه کنید.
4. 10 میکرولیتر از معرف CCK-8 را به هر چاهک اضافه کنید (مراقب باشید حباب ها به چاه ها وارد نشود، زیرا با خواندن OD تداخل دارند) و به آرامی مخلوط کنید.
5. پلیت را در دستگاه جوجه کشی قرار داده و به مدت 1-4 ساعت انکوبه کنید.
6. جذب را در 450 نانومتر با میکروپلیت خوان اندازه گیری کنید.
7. اگر مقدار OD بلافاصله اندازه گیری نشد، 10 میکرولیتر محلول HCl 0.1 مولار یا محلول 1% w/v SDS را به هر چاهک اضافه کنید، روی صفحه را بپوشانید و آن را با محافظت در برابر نور در دمای اتاق نگهداری کنید. مقدار جذب ظرف 24 ساعت تغییر نمی کند.
توجه: اگر ماده در حال اکسید شدن یا احیا است، قبل از افزودن معرف CCK-8، محیط کشت تازه را با محیط کشت تازه جایگزین کنید (محیط قدیمی را بردارید، سلول ها را دو بار با محیط تازه بشویید و سپس محیط تازه اضافه کنید) تا اثر ماده از بین برود.اگر خود ماده فقط داشته باشد الف اندک با تأثیر بر مقدار جذب، نیازی به جایگزینی محیط کشت نیست و با کم کردن مقدار جذب یک گروه سفید با ماده، می توان اثر ماده را از بین برد.
فرمول محاسبه
میزان بقای سلولی =[(AC) /(BC)] x100%
نرخ بازداری =[(BA) /(BC)] x100%
ج: جذب گروه آزمایش (جذب محیط کشت حاوی سلول ها، معرف CCK-8 و ماده مورد آزمایش)
ب: میزان جذب گروه کنترل (جذب محیط کشت حاوی سلول ها، معرف CCK-8)
ج: جذب گروه بلانک (جذب محیط کشت حاوی معرف CCK-8)
نقل قول ها
[1] Sun L، Li P، Ju X، و همکاران. در خصوصیات ساختاری داخل بدن ژنوم RNA SARS-CoV-2 پروتئینهای میزبان آسیبپذیر در برابر داروهای تغییر کاربری را شناسایی میکند. سلول 2021؛ 184 (7): 1865-1883.e20. doi:10.1016/j.cell.2021.02.008(IF: 41.584)
[2] وی اس، ژائو کیو، ژنگ کی، و همکاران. گلوتامیلاسیون TAB1 مرتبط با GFAT1 فعال سازی MAPK p38 را حفظ می کند و بقای سلول های سرطانی ریه را در شرایط گرسنگی گلوکز افزایش می دهد. Cell Discov. 2022؛ 8 (1): 77. منتشر شده در 9 اوت 2022. doi:10.1038/s41421-022-00423-0(IF: 38.079)
[3] Chen X، Zhang D، Su N، و همکاران. تجسم دینامیک RNA در سلول های زنده با RNA های فلورسنت روشن و پایدار. Nat Biotechnol. 2019؛ 37 (11): 1287-1293. doi:10.1038/s41587-019-0249-1(IF: 31.864)
[4] Yang F، Xiao Y، Ding JH، و همکاران. ناهمگونی فروپتوز در سرطان سینه سه گانه منفی یک استراتژی ترکیبی ایمونوتراپی ابتکاری را نشان می دهد [منتشر شده آنلاین قبل از چاپ، 11 اکتبر 2022]. سلول متاب. 2022؛ S1550-4131(22)00411-9. doi:10.1016/j.cmet.2022.09.021(IF: 31.373)
[5] Rong QX، Wang F، Guo ZX، و همکاران. GM-CSF فرار سیستم ایمنی را از طریق تنظیم دخیل در بیان PD-L1 در لنفوم سلولی کشنده طبیعی خارج گرهی / سلول T واسطه می کند. مول سرطان. 2021؛ 20 (1): 80. منتشر شده در 29 مه 2021. doi:10.1186/s12943-021-01374-y(IF: 27.401)
[6] Xia B، Shen X، He Y، و همکاران. پروتئین پوششی SARS-CoV-2 باعث آسیب های پاتولوژیک شبیه سندرم زجر تنفسی حاد (ARDS) می شود و یک هدف ضد ویروسی است. Cell Res. 2021؛ 31 (8): 847-860. doi:10.1038/s41422-021-00519-4(IF: 25.617)
[7] یانگ ایکس، ژائو ایکس، ژو وای و همکاران. FBXO34 فعال سازی پنهان HIV-1 را با مدولاسیون پس از رونویسی ترویج می کند. میکروب های ظهور می کنند. 2022؛ 11 (1): 2785-2799. doi:10.1080/22221751.2022.2140605(IF: 19.568)
[8] Zhou Z، Zhang X، Lei X، و همکاران.سنجش کروماتین سیتوپلاسمی توسط cGAS پاسخ ایمنی ذاتی را در عفونت SARS-CoV-2 فعال می کند. هدف انتقال سیگنال در آنجا. 2021؛ 6 (1): 382. منتشر شده در 3 نوامبر 2021. doi:10.1038/s41392-021-00800-3(IF: 18.187)
[9] لی ام، هائو بی، ژانگ ام، و همکاران. ملاتونین ایمنی ضد توموری NK ناشی از فرکانس رادیویی را افزایش می دهد و باعث برنامه ریزی مجدد متابولیسم سرطان و مهار رشد تومورهای ریوی متعدد می شود. هدف انتقال سیگنال در آنجا. 2021؛ 6 (1): 330. منتشر شده در 1 سپتامبر 2021. doi:10.1038/s41392-021-00745-7(IF: 18.187)
[10] Qi S، Zhu Y، Liu X، و همکاران. پروتئینهای WWC فعالسازی LATS1/2 توسط Hippo kinases را واسطه میکنند و به استراتژی سرکوب تومور دلالت میکنند. سلول مول. 2022؛ 82 (10): 1850-1864.e7. doi:10.1016/j.molcel.2022.03.027(IF: 17.970)
[11] Zhu J، Li X، Cai X، و همکاران. مونومتیلاسیون آرژنین توسط PRMT7 ایمنی ذاتی ضد ویروسی با واسطه MAVS را کنترل می کند. سلول مول. 2021؛ 81 (15): 3171-3186.e8. doi:10.1016/j.molcel.2021.06.004(IF: 17.970)
[12] Teng KX، Niu LY، Xie N، Yang QZ. عوامل فوتودینامیک فوق مولکولی برای اکسیداسیون همزمان NADH و تولید رادیکال سوپراکسید. Nat Commun. 2022؛ 13 (1): 6179. منتشر شده در 19 اکتبر 2022. doi:10.1038/s41467-022-33924-3(IF: 17.694)
[13] Zhong J، Guo Y، Lu S، و همکاران. طراحی منطقی یک ردیاب با حساسیت برای کشف مهارکنندههای کارآمد APC-Asef. Nat Commun. 2022؛ 13 (1): 4961. منتشر شده در 24 اوت 2022. doi:10.1038/s41467-022-32612-6(IF: 17.694)
[14] لیو اف، وانگ ایکس، دوان جی، و همکاران. یک تخریب متوالی با واسطه کوکتل پروتاک موقتی AURKA سلول های بنیادی لوسمی میلوئید حاد را لغو می کند. Adv Sci (Weinh). 2022؛ 9 (22): e2104823. doi:10.1002/advs.202104823(IF: 16.806)
[15] جی سی، کیو ام، روان اچ، و همکاران. تجزیه و تحلیل رونوشت، طاقچه های همزیستی داربست های سه بعدی را برای تسریع بهبودی نقص استخوان نشان داد. Adv Sci (Weinh). 2022؛ 9 (8): e2105194. doi:10.1002/advs.202105194(IF: 16.806)
[16] Feng L، Dou C، Xia Y، و همکاران. نانوزیم درمانی پوشش داده شده با غشای سلولی شبه نوتروفیل برای آسیب مغزی ایسکمیک و بازیابی عملکردی عصبی طولانی مدت. نانو ACS. 2021؛ 15 (2): 2263-2280. doi:10.1021/acsnano.0c07973(IF: 15.881)
[17] وانگ زی، گونگ ایکس، لی جی، و همکاران. نانوخودروهای پلی فلوئوروکربنی اکسیژن رسانی، اکسیژن رسانی تومور را بهبود می بخشد و ایمنی ضد تومور با واسطه فتودینامیک را تقویت می کند. نانو ACS. 2021؛ 15 (3): 5405-5419. doi:10.1021/acsnano.1c00033(IF: 15.881)
[18] Jiang Z، He L، Yu X، و همکاران. ضد رگ زایی همراه با مهار مسیر هیپوکسی، درمان فوتودینامیک ناشی از اشعه ایکس با دوز پایین را تسهیل می کند [منتشر شده آنلاین قبل از چاپ، 25 ژوئن 2021]. نانو ACS. 2021; 10.1021/acsnano.1c01063. doi:10.1021/acsnano.1c01063(IF: 15.881)
[19] گونگ ایکس، لی جی، زو ایکس، و همکاران. نانوسیستم اکسیژنرسان الهام گرفته از میکرووزیکول، مدولاسیون استرومای تومور و ایمنی ضد تومور را با واسطه رادیوتراپی تقویت میکند. بیومواد. 2022؛ 290:121855. doi:10.1016/j.biomaterials.2022.121855(IF: 15.304)
[20] Deng J، Xu W، Lei S، و همکاران. جذب و بلوغ سلول های دندریتیک وابسته به سلول های کشنده طبیعی فعال شده توسط نانوژل های پاسخگو برای هدف قرار دادن ایمونوتراپی سرطان پانکراس. کوچک. 2022؛ 18 (44): e2203114. doi:10.1002/smll.202203114(IF: 15.153)
پرداخت و امنیت
اطلاعات پرداخت شما با اطمینان پردازش می شود. ما جزئیات کارت اعتباری را ذخیره نمی کنیم و به اطلاعات کارت اعتباری شما دسترسی نداریم.
تحقیق
شما همچنین ممکن است دوست داشته باشید
پرسش
این محصول فقط برای اهداف تحقیقاتی است و برای استفاده درمانی یا تشخیصی در انسان یا حیوانات در نظر گرفته نشده است. محصولات و محتوا توسط پتنت ها، علائم تجاری، و حق چاپ متعلق به Yeasen Biotechnology محافظت می شوند. نمادهای علامت تجاری نشان دهنده کشور مبدا هستند، نه لزوما ثبت در همه مناطق.
برخی از برنامههای کاربردی ممکن است به حقوق مالکیت معنوی شخص ثالث دیگری نیاز داشته باشند.
Yeasen به علم اخلاق اختصاص داده شده است و معتقد است که تحقیقات ما باید به سؤالات مهم و در عین حال اطمینان از ایمنی و استانداردهای اخلاقی بپردازد.