شرح
کیت تشخیص آپوپتوز سلولی Annexin V-EGFP/PI از Annexin V با برچسب EGFP به عنوان یک کاوشگر برای تشخیص وقوع آپوپتوز سلولی اولیه استفاده می کند.
اصل تشخیص به شرح زیر است: در سلول های زنده طبیعی، فسفوتیدیل سرین (PS) در سمت داخلی غشای سلولی قرار دارد، اما در سلول های آپوپتوز اولیه، PS از سمت داخلی غشای سلولی به سطح غشای سلولی می چرخد و در معرض محیط خارج سلولی قرار می گیرد. Annexin-V یک Ca است2+ پروتئین وابسته به فسفولیپید با وزن مولکولی 35 تا 36 کیلو دالتون که با میل ترکیبی بالا به PS متصل می شود. سرین فسفاتیدیل می تواند از طریق فسفاتیدیل سرین در معرض در خارج از سلول به غشای سلول های آپوپتوز اولیه متصل شود.
علاوه بر این، پروپیدیوم یدید (PI) برای تشخیص سلول‌های اولیه زنده‌مانده از سلول‌های نکروزه یا آپوپتوز دیررس ارائه می‌شود. PI یک رنگ اسید نوکلئیک است که نمی تواند از غشای سلولی سالم سلول های طبیعی یا سلول های آپوپتوز اولیه عبور کند، اما می تواند از غشای سلولی سلول های آپوپتوز و نکروز دیررس عبور کند و هسته را قرمز کند. بنابراین، هنگامی که Annexin V با PI ترکیب شد، PI از سلول های زنده حذف شد (Annexin V-/PI-و سلول های آپوپتوز اولیه (Annexin V+/PI-). سلول های آپوپتوز و نکروز دیررس برای هر دو EGFP و PI دو برابر مثبت بودند (Annexin V+/PI+).
این کیت برای فلوسیتومتری و میکروسکوپ فلورسانس مناسب است.
اجزای محصول
| جزء |
| 40303ES20 (20 T) | 40303ES50 (50 T) | 40303ES60 (100 T) |
| 40303-A | Annexin V-EGFP | 0.1 میلی لیتر | 0.25 میلی لیتر | 0.5 میلی لیتر |
| 40303-B | محلول رنگ آمیزی PI | 0.2 میلی لیتر | 0.5 میلی لیتر | 1 میلی لیتر |
| 40303-C | 1×بافر اتصال | 10 میلی لیتر | 25 میلی لیتر | 50 میلی لیتر |
حمل و نقل و ذخیره سازی
قطعات همراه با کیسه یخ ارسال می شوند و می توان آنها را در دمای -20 درجه سانتیگراد نگهداری کرد و دور از نور قرار داد و از انجماد و ذوب مکرر به مدت 1 سال جلوگیری کرد.
[نکته]: در صورت نیاز به استفاده مکرر در مدت کوتاه، می توان آن را در دمای 4 درجه سانتیگراد نگهداری کرد و به مدت نیم سال از نور محافظت کرد.
هشدارها
1) از آنجایی که آپوپتوز یک فرآیند سریع است، توصیه می شود نمونه ها در عرض 1 ساعت پس از رنگ آمیزی آنالیز شوند.
2) برای سلول های چسبنده، هضم یک مرحله حیاتی است. از EDTA در محلول گوارشی استفاده نکنید زیرا EDTA می تواند بر اتصال Annexin V به PS تأثیر بگذارد.
3) Annexin V-FITC، اما نه Annexin V-EGFP، باید برای تثبیت سلول ها، مانند تشخیص آپوپتوز و چرخه سلولی به طور همزمان استفاده شود، زیرا EGFP دناتوره می شود و توانایی خود را برای تحریک فلورسانس در طول تثبیت از دست می دهد. قبل از تثبیت، سلول‌ها با Annexin V-FITC انکوبه شدند و Annexin V-FITC بدون اتصال با بافر اتصال شسته شد.زیرا افزایش نفوذپذیری سلول در طول تثبیت، بقایای سلولی را ایجاد می کند که می تواند به Annexin V متصل شود و در نتایج اختلال ایجاد کند.
4) اگر نمونه از خون است، حتما پلاکت ها را از خون خارج کنید. زیرا پلاکت ها حاوی PS هستند که می تواند به Annexin V متصل شود و در نتایج اختلال ایجاد کند. پلاکت ها را می توان با استفاده از یک بافر حاوی EDTA و سانتریفیوژ در 200 گرم شستشو داد.
5) لطفاً قبل از باز کردن درپوش، معرف را برای مدت کوتاهی سانتریفیوژ کنید و مایع را روی دیواره داخلی درپوش تا انتهای لوله بریزید تا هنگام باز کردن درپوش از پاشیدن مایع جلوگیری شود.
6) Annexin V-EGFP و PI مواد حساس به نور هستند، بنابراین لطفاً در حین کار از نور اجتناب کنید.
7) فقط برای استفاده تحقیقاتی!
دستورالعمل ها
طراحی آزمایش
لوله خالی: سلول های کنترل منفی بدون Annexin V-EGFP و محلول رنگ آمیزی PI برای تنظیم ولتاژ استفاده شد.
لوله‌های رنگ‌آمیزی منفرد: سلول‌های کنترل مثبت، که فقط با Annexin V-EGFP تکمیل شده‌اند، برای تعدیل جبران استفاده شدند.
لوله تشخیص: سلول ها با Annexin V-EGFP و محلول رنگ آمیزی PI تیمار شدند. داده های تجربی با تنظیم پارامترهای لوله خالی و لوله رنگی به دست آمد.
1.1 نمونه رنگرزی
1) سلول معلق: سلول ها با سانتریفیوژ در 300 گرم به مدت 5 دقیقه در دمای 4 درجه سانتی گراد جمع آوری شدند.
سلول چسبنده: پس از هضم با تریپسین بدون EDTA، سلول ها با سانتریفیوژ در 300 گرم به مدت 5 دقیقه در دمای 4 درجه سانتی گراد برداشت شدند. زمان هضم تریپسین برای جلوگیری از مثبت کاذب نباید خیلی طولانی باشد.
2) سلول ها با PBS از قبل خنک شده دو بار، هر بار در 300 گرم شسته و به مدت 5 دقیقه در دمای 4 درجه سانتیگراد سانتریفیوژ شدند.
3) سلول ها با بافر اتصال 1 × معلق شدند و غلظت به 106×106 × 5 / میلی لیتر تنظیم شد.
4) 100 میکرولیتر سوسپانسیون سلولی به لوله های فلوسیتومتری 5 میلی لیتری اضافه شد، 5 میکرولیتر Annexin V-EGFP اضافه شد و سلول ها مخلوط شدند و به مدت 5 دقیقه در دمای اتاق زیر نور انکوبه شدند.
5) با افزودن 10 میکرولیتر محلول PI و 400 میکرولیتر PBS، رنگ‌آمیزی بلافاصله انجام شد.
[یادداشت]: هنگام استفاده از فلوسیتومتری برای تشخیص آپوپتوز، PI تا حد زیادی تحت تأثیر زمان قرار می‌گیرد و زمان بیش از حد طولانی منجر به افزایش رنگ‌آمیزی PI می‌شود، بنابراین فلوسیتومتری باید در عرض 1 ساعت کامل شود.
1.2 آنالیز فلوسیتومتری
حداکثر طول موج تحریک EGFP 488 نانومتر و حداکثر طول موج انتشار 507 نانومتر بود. حداکثر طول موج تحریک مجتمع PI-DNA 535 نانومتر و حداکثر طول موج انتشار 615 نانومتر بود. نرم افزاری مانند CellQuest برای تجزیه و تحلیل استفاده شد و نمودار نقطه دو رنگ ترسیم شد، EGFP ابسیسا و PI مختصات است. 10000 رویداد در هر نمونه جمع آوری کنید. در یک آزمایش معمولی، سلول‌ها را می‌توان به سه زیر گروه تقسیم کرد، سلول‌های زنده فقط دارای فلورسانس پس‌زمینه با شدت بسیار پایین، سلول‌های آپوپتوز اولیه فقط دارای فلورسانس سبز قوی هستند و سلول‌های آپوپتوز دیررس دارای رنگ‌آمیزی دوگانه فلورسانس سبز و قرمز هستند.
پرداخت و امنیت
اطلاعات پرداخت شما با اطمینان پردازش می شود. ما جزئیات کارت اعتباری را ذخیره نمی کنیم و به اطلاعات کارت اعتباری شما دسترسی نداریم.
تحقیق
شما همچنین ممکن است دوست داشته باشید
پرسش
این محصول فقط برای اهداف تحقیقاتی است و برای استفاده درمانی یا تشخیصی در انسان یا حیوانات در نظر گرفته نشده است. محصولات و محتوا توسط پتنت ها، علائم تجاری، و حق چاپ متعلق به Yeasen Biotechnology محافظت می شوند. نمادهای علامت تجاری نشان دهنده کشور مبدا هستند، نه لزوما ثبت در همه مناطق.
برخی از برنامه‌های کاربردی ممکن است به حقوق مالکیت معنوی شخص ثالث دیگری نیاز داشته باشند.
Yeasen به علم اخلاق اختصاص داده شده است و معتقد است که تحقیقات ما باید به سؤالات مهم و در عین حال اطمینان از ایمنی و استانداردهای اخلاقی بپردازد.