اصل تشخیص کیت تشخیص آپوپتوز Annexin V-Alexa Fluor488/PI به شرح زیر است: در سلول‌های زنده عادی، فسفوتیدیل سرین (PS) در سمت داخلی غشای سلولی قرار دارد، اما در سلول‌های آپوپتوز اولیه، PS از سمت داخلی غشای سلولی به سمت سطح غشای سلولی به سمت محیط خارج سلولی می‌چرخد. Annexin-V یک Ca است²⁺ پروتئین متصل شونده به فسفولیپید وابسته با وزن مولکولی 35 تا 36 کیلو دالتون، که با میل ترکیبی بالا به PS متصل می شود و از طریق فسفاتیدیل سرین که در خارج از سلول قرار می گیرد به غشای سلولی سلول های آپوپتوز اولیه متصل می شود.
علاوه بر این، پروپیدیوم یدید (PI) برای تشخیص سلول‌های اولیه زنده‌مانده از سلول‌های نکروزه یا آپوپتوز دیررس ارائه می‌شود. PI یک رنگ اسید نوکلئیک است که نمی تواند از غشای سلولی سالم سلول های طبیعی یا سلول های آپوپتوز اولیه عبور کند، اما می تواند از غشای سلولی سلول های آپوپتوز و نکروز دیررس عبور کند و هسته را قرمز کند. بنابراین، هنگامی که Annexin V با PI ترکیب شد، PI از سلول های زنده حذف شد (Annexin V^-/PI^-و سلول های آپوپتوز اولیه (Annexin V⁺/PI^-). در مقابل، سلول‌های آپوپتوز و نکروز دیررس برای Alexa Fluor488 و PI دو مثبت بودند (Annexin V⁺/PI⁺).

اجزای محصول

حمل و نقل و ذخیره سازی

قطعات با کیسه یخ ارسال می شوند و می توانند به مدت 1 سال در دمای -20 درجه سانتیگراد نگهداری شوند.

هشدارها

1) از آنجایی که آپوپتوز یک فرآیند سریع است، توصیه می شود نمونه ها در عرض 1 ساعت پس از رنگ آمیزی آنالیز شوند.
2) برای سلول های چسبنده، هضم یک مرحله حیاتی است. از EDTA در محلول گوارشی استفاده نکنید زیرا EDTA می تواند بر اتصال Annexin V به PS تأثیر بگذارد.
3) اگر نمونه از خون است، حتما پلاکت ها را از خون خارج کنید. زیرا پلاکت ها حاوی PS هستند که می تواند به Annexin V متصل شود و در نتایج اختلال ایجاد کند. می توان از یک بافر حاوی EDTA استفاده کرد و پلاکت ها را با سانتریفیوژ در 200 گرم شست.
4) لطفاً قبل از باز کردن درپوش، معرف را برای مدت کوتاهی سانتریفیوژ کنید و مایع را روی دیواره داخلی درپوش تا انتهای لوله بریزید تا هنگام باز کردن درپوش از پاشیدن مایع جلوگیری شود.
5) Annexin V-Alexa Fluor488 و PI مواد حساس به نور هستند و هنگام دست زدن باید دور از نور نگهداری شوند.
6) فقط برای استفاده تحقیقاتی!

دستورالعمل ها

1.1 نمونه رنگرزی
۱-الف) سلول معلق: سلول ها با سانتریفیوژ در 300 گرم به مدت 5 دقیقه در دمای 4 درجه سانتی گراد جمع آوری شدند.
ب) سلول چسبنده: پس از هضم با تریپسین بدون EDTA، سلول ها با سانتریفیوژ در 300 گرم به مدت 5 دقیقه در دمای 4 درجه سانتی گراد برداشت شدند. زمان هضم تریپسین نباید خیلی طولانی باشد تا از مثبت کاذب جلوگیری شود.
2. سلولها دو بار با PBS که در دمای 4 درجه سانتیگراد از قبل خنک شده بود، هر بار با استفاده از 300 گرم شسته شدند و به مدت 5 دقیقه در دمای 4 درجه سانتیگراد سانتریفیوژ شدند.
3. سلول ها با افزودن 250 میکرولیتر 1×بافر اتصال مجدد معلق شدند و غلظت به 106×1/mL تنظیم شد.
4. 100 میکرولیتر سوسپانسیون سلولی به یک لوله فلوسیتومتری 5 میلی لیتری، 5 میکرولیتر Annexin V-Alexa Fluor 488 و 10 میکرولیتر PI اضافه شد و به آرامی مخلوط شد.
5. واکنش دور از نور و به مدت 15 دقیقه در دمای اتاق نگهداری شد.
6. 400 میکرولیتر از بافر اتصال 1 × اضافه شد، مخلوط شد و نمونه ها با فلوسیتومتری در عرض 1 ساعت شناسایی شدند.
[یادداشت ها]: برای جلوگیری از از دست رفتن سلول در طول شستشوی سلول، می توان از یک نوک کوچک برای تنفس مایع استفاده کرد.
1.2 آنالیز فلوسیتومتری
الکسا Fluor488 دارای حداکثر طول موج تحریک 488 نانومتر و حداکثر طول موج انتشار 519 نانومتر است. حداکثر طول موج تحریک کمپلکس PI-DNA 535 نانومتر و حداکثر طول موج انتشار 615 نانومتر بود. از CellQuest و نرم افزارهای دیگر برای تجزیه و تحلیل و ترسیم یک نمودار نقطه دو رنگ با Alexa Fluor488 به عنوان ابسیسا و PI به عنوان مختصات استفاده شد. 10000 رویداد در هر نمونه جمع آوری کنید.
1.3 تجزیه و تحلیل میکروسکوپ فلورسانس
1) یک قطره از سوسپانسیون سلولی دوبار رنگ آمیزی شده با Annexin V-FITC/PI را روی لام بریزید و سلول ها را با یک لام پوششی بپوشانید.
2) زیر میکروسکوپ فلورسانس با فیلتر دو رنگ مشاهده شد. سیگنال فلورسانس Annexin V-FITC سبز و سیگنال فلورسانس PI قرمز بود.