هنگامی که سلول ها تحت آپوپتوز قرار می گیرند، آنزیم های اندونوکلئاز را فعال می کنند که DNA ژنومی بین نوکلئوزوم ها را قطع می کند. نردبان DNA 180-200 جفت باز پس از استخراج DNA در حین آپوپتوز توسط الکتروفورز شناسایی شد.
کیت تشخیص آپوپتوز TUNEL (TdT mediated dUTP Nick End Labeling) (Alexa Fluor 488) می تواند برای تشخیص تکه تکه شدن DNA هسته ای در فرآیند آپوپتوز دیررس سلول های بافتی استفاده شود. اصل این است که تحت عمل ترانسفراز ترمینال دئوکسی نوکلئوتیدیل (TdT)، الکسا فلور 488-12-DUTP در ترمینال 3' -هیدروکسیل (3'-OH) که در طول شکست DNA ژنومی در معرض قرار می گیرد، ترکیب می شود. بنابراین، می توان آن را با میکروسکوپ فلورسانس یا فلوسیتومتری تشخیص داد.
رنگ Alexa Fluor 488 پایدارتر است و سیگنال قوی تری دارد و در نتیجه نشانگرهای روشن تر و مقاومت بیشتری در برابر خاموش شدن دارد.
این کیت کاربردهای گسترده ای دارد و می توان از آن برای تشخیص آپوپتوز در مقاطع منجمد یا پارافینی و همچنین در سلول های چسبنده یا معلق کشت شده استفاده کرد.

اجزای محصول

حمل و نقل و ذخیره سازی

قطعات با کیسه یخ ارسال می شوند و می توان آنها را در دمای -20 درجه سانتیگراد برای 1 نگهداری کرد سال

هشدارها

1. لازم است PBS خود را برای شستشوی سلول ها، محلول خاموش کننده ضد فلورسانس برای آب بندی قرص ها و 4% پارافورمالدئید برای تثبیت آماده کنید.

2. فقط برای استفاده تحقیقاتی!

دستورالعمل ها

1. آماده سازی نمونه
1.1 مقاطع بافتی تعبیه شده با پارافین
1.1.1. مقاطع بافت پارافینی به مدت 5 دقیقه در دمای اتاق در زایلن غوطه ور شدند و یک بار تکرار شدند تا پارافین به طور کامل حذف شود.
1.1.2. بخش ها را در اتانول 100% به مدت 5 دقیقه در دمای اتاق خیس کنید و یک بار تکرار کنید.
1.1.3. در دمای اتاق، نمونه ها هر بار به مدت 3 دقیقه با اتانول گرادیان (90، 80، 70 درصد) خیسانده شدند.
1.1.4. بخش ها را به آرامی با PBS بشویید و مایع اضافی اطراف نمونه را روی لام های شیشه ای به دقت با کاغذ صافی پاک کنید. در این حالت می توان از قلم پارافین یا قلم آبگریز برای ترسیم طرح کلی توزیع نمونه در اطراف نمونه استفاده کرد که برای پردازش نفوذپذیری پایین دست و عملیات برچسب گذاری تعادل مناسب است. اجازه ندهید نمونه در طول آزمایش خشک شود. نمونه فرآوری شده را در جعبه مرطوب قرار دهید تا نمونه خیس بماند.
محلول 1.1.5.2 mg/mL پروتئیناز K با PBS به نسبت 1:100 رقیق شد تا به غلظت نهایی 20 میکروگرم بر میلی لیتر برسد.
1.1.6.100 میکرولیتر محلول Proteinase K با غلظت 20 میکروگرم بر میلی لیتر به هر نمونه اضافه شد تا کاملاً آن را بپوشاند و به مدت 20 دقیقه در دمای اتاق انکوبه شد.
[یادداشت ها]: پروتئیناز K به بافت ها و سلول ها کمک می کند تا در مراحل بعدی نسبت به معرف های رنگ آمیزی نفوذ کنند. زمان انکوباسیون بیش از حد طولانی خطر افتادن بخش‌های بافت از صفحه حامل در مراحل بعدی شستشو را افزایش می‌دهد، در حالی که زمان انکوباسیون بسیار کوتاه ممکن است باعث نفوذپذیری ناکافی شود و بر کارایی برچسب‌گذاری تأثیر بگذارد. برای به دست آوردن نتایج بهتر، ممکن است لازم باشد زمان انکوباسیون پروتئیناز K بهینه شود.
1.1.7. نمونه را 2-3 بار با محلول PBS بشورید، مایع اضافی را به آرامی خارج کنید و مایع اطراف نمونه را با احتیاط روی لام با کاغذ صافی پاک کنید. نمونه پردازش شده در جعبه مرطوب قرار می گیرد تا نمونه مرطوب بماند.
1.2 بخش منجمد بافت
1.2.1. بخش های یخ زده را بردارید و به دمای اتاق برگردانید. اسلایدها در محلول پارافرمالدئید 4 درصد (محلول در PBS) غوطه ور شدند و ثابت و به مدت 30 دقیقه در دمای اتاق انکوبه شدند.
1.2.2. مایع اضافی را به آرامی خارج کنید و از کاغذ صافی استفاده کنید تا مایع اضافی اطراف نمونه را روی لام شیشه ای به دقت پاک کنید.
1.2.3. اسلایدها در محلول PBS غوطه ور شدند، در دمای اتاق به مدت 15 دقیقه انکوبه شدند و در مجموع 2 بار با PBS شسته شدند.
1.2.4. مایع اضافی را به آرامی خارج کنید و لام شیشه ای را به دقت با کاغذ صافی پاک کنید تا مایع اضافی از اطراف نمونه خارج شود. در این حالت می توان از قلم پارافین یا قلم آبگریز برای ترسیم طرح کلی توزیع نمونه در اطراف نمونه استفاده کرد که برای پردازش نفوذپذیری پایین دست و عملیات برچسب گذاری تعادل مناسب است. در طول آزمایش اجازه ندهید نمونه خشک شود و نمونه فرآوری شده را در جعبه مرطوب قرار دهید تا نمونه مرطوب بماند.
1.2.5. محلول 2 میلی گرم بر میلی لیتر پروتئیناز K با PBS به نسبت 1:100 رقیق شد تا به غلظت نهایی 20 میکروگرم بر میلی لیتر برسد.
1.2.6. 100 میکرولیتر محلول پروتئیناز K با غلظت 20 میکروگرم بر میلی لیتر به هر نمونه اضافه شد تا کاملاً آن را بپوشاند و به مدت 10 دقیقه در دمای اتاق انکوبه شد.
[یادداشت ها]: پروتئیناز K به بافت ها و سلول ها کمک می کند تا در مراحل بعدی نسبت به معرف های رنگ آمیزی نفوذ کنند. زمان انکوباسیون بیش از حد طولانی خطر افتادن بخش‌های بافت از صفحه حامل در مراحل بعدی شستشو را افزایش می‌دهد، در حالی که زمان انکوباسیون بسیار کوتاه ممکن است باعث نفوذپذیری ناکافی شود و بر کارایی برچسب‌گذاری تأثیر بگذارد. اگر نتایج بهتری به دست نیامد، ممکن است لازم باشد زمان انکوباسیون پروتئیناز K بهینه شود.
1.2.7. نمونه را 2 تا 3 بار در یک لیوان باز حاوی محلول PBS شستشو دهید.
[نکته]: برای جلوگیری از از بین رفتن لایه برداری نمونه در مرحله تمیز کردن، توصیه می شود بطری را نشویید، بلکه لام های شیشه را برای تمیز کردن 2 تا 3 بار در محلول PBS خیس کنید.
1.2.8. مایع اضافی را به آرامی بردارید و از کاغذ صافی استفاده کنید تا مایع اطراف نمونه روی لام را با دقت پاک کنید.نمونه فرآوری شده در جعبه مرطوب قرار می گیرد تا رطوبت نمونه حفظ شود.
1.3 تهیه صفحه خزیدن سلولی
سلول های چسبنده بر روی Lab-Tek of Chamber Slides کشت داده شدند. پس از درمان القای آپوپتوز، لام ها دو بار با PBS شسته شدند.
1.4 تهیه اسمیر سلولی (به عنوان مثال از اسلایدهای پوشش داده شده با پلی لیزین استفاده کنید)
1.4.1. سلول ها در PBS با غلظت حدود 2 × 107 سلول در میلی لیتر معلق شدند، 50-100 میکرولیتر از سوسپانسیون سلولی روی لام های پوشش داده شده با پلی لیزین آسپیره شد و سوسپانسیون سلولی به آرامی با یک لام تمیز باز شد.
1.4.2. سلول ها ثابت شدند و لام ها در یک مخزن رنگ آمیزی حاوی 4% پارافورمالدئید تازه آماده شده در PBS غوطه ور شدند و به مدت 25 دقیقه در دمای 4 درجه سانتی گراد قرار گرفتند.
1.4.3. لام ها شسته شدند، در PBS غوطه ور شدند و به مدت 5 دقیقه در دمای اتاق قرار گرفتند. دوباره با PBS بشویید.
1.4.4. مایع اضافی را به آرامی خارج کنید و لام شیشه ای را به دقت با کاغذ صافی پاک کنید تا مایع اضافی از اطراف نمونه خارج شود. در این مورد، می توان از یک قلم پارافینی یا قلم آبگریز برای ترسیم توزیع نمونه در اطراف نمونه استفاده کرد تا عملیات برچسب گذاری تعادل پایین دست و پردازش نفوذپذیری را تسهیل کند. در طول آزمایش اجازه ندهید نمونه خشک شود و نمونه فرآوری شده را در جعبه مرطوب قرار دهید تا نمونه مرطوب بماند.
1.4.5. محلول 2 میلی گرم بر میلی لیتر پروتئیناز K با PBS به نسبت 1:100 رقیق شد تا به غلظت نهایی 20 میکروگرم بر میلی لیتر برسد.
1.4.6. 100 میکرولیتر محلول پروتئیناز K با غلظت 20 میکروگرم بر میلی لیتر به هر نمونه اضافه شد تا کاملاً پوشانده شود و به مدت 5 دقیقه در دمای اتاق انکوبه شود (همچنین می توان آن را در محلول 2/0 درصد Triton X-100 تهیه شده در PBS غوطه ور کرد و برای عملیات نفوذپذیری در دمای اتاق به مدت 5 دقیقه انکوبه کرد).
[یادداشت ها]: پروتئیناز K به بافت ها و سلول ها کمک می کند تا در مراحل بعدی نسبت به معرف های رنگ آمیزی نفوذ کنند. زمان انکوباسیون بیش از حد طولانی خطر افتادن بخش‌های بافت از صفحه حامل در مراحل بعدی شستشو را افزایش می‌دهد، در حالی که زمان انکوباسیون بسیار کوتاه ممکن است باعث نفوذپذیری ناکافی شود و بر کارایی برچسب‌گذاری تأثیر بگذارد. اگر نتایج بهتری به دست نیامد، ممکن است لازم باشد زمان انکوباسیون پروتئیناز K بهینه شود.
1.4.7. نمونه را 2 تا 3 بار با PBS بشویید، مایع اضافی را به آرامی خارج کنید و مایع اطراف نمونه را با دقت روی لام با کاغذ صافی پاک کنید. نمونه های پردازش شده در یک جعبه مرطوب قرار گرفتند.
2. مراحل درمان با DNase کنترل های مثبت
پس از نفوذ نمونه، سلول ها با DNase I برای تهیه اسلایدهای کنترل مثبت تیمار شدند. این فرآیند معمولا باعث ایجاد بیشتر سلول ها می شود برای نشان دادن فلورسانس سبز درمان شده است.
[یادداشت]: درمان با Dnase I سلول‌های بی‌حرکت باعث شکسته شدن DNA کروموزومی می‌شود و 3 '-انتهای DNA تولید می‌کند که می‌توان آنها را نشان‌دار کرد.
2.1. بافر 10 × DNase I را با آب دیونیزه به نسبت 1:10 رقیق کنید (برای هر نمونه 200 میکرولیتر بافر 1× DNase I مورد نیاز است، یعنی 20 میکرولیتر بافر 10 × DNase I و 180 میکرولیتر آب دیونیزه شده برای رقیق سازی مورد نیاز است). قطره 100 میکرولیتر به نمونه نفوذپذیر اضافه شد و به مدت 5 دقیقه در دمای اتاق انکوبه شد. 1 میکرولیتر DNase I (1U/μL) را به 100 میکرولیتر باقیمانده بافر 1 × DNase I اضافه کنید تا غلظت نهایی 10 U/mL حاصل شود.
2.2. مایع به آرامی جدا شد، سپس 100 میکرولیتر بافر حاوی 10 U/mL DNase I اضافه شد و به مدت 10 دقیقه در دمای اتاق انکوبه شد.
2.3. روی لام ضربه بزنید تا مایع اضافی خارج شود و لام را به طور کامل 3-4 بار در یک مخزن رنگ با آب دیونیزه بشویید.
[یادداشت ها]: برای لام های کنترل مثبت باید از یک مخزن رنگ آمیزی جداگانه استفاده شود، در غیر این صورت باقیمانده DNase I در لام های کنترل مثبت ممکن است پس زمینه بالایی را در لام های آزمایشی ایجاد کند.
3. برچسب زدن و تشخیص
3.1.بافر تعادل (بافر تعادل 5 ×) با آب دیونیزه شده به نسبت 1:5 رقیق می شود (100μL 1×بافر تعادل برای هر نمونه مورد نیاز است).
3.2. بافر تعادل (100μL 1× بافر تعادل) به هر نمونه اضافه شد تا منطقه کاملاً متعادل شود و به مدت 10-30 دقیقه در RT انکوبه شد. روش دیگر، برای اطمینان از تعادل اسلایدها، داخل یک VAT با 1 x بافر تعادل قرار دهید. الکسا فلوئور 488-12-DUTP برچسب زدن را بر روی یخ مخلوط کنید و سلول‌ها را متعادل کنید و بافر انکوباسیون TdT کافی را برای همه آزمایش‌ها و واکنش‌های کنترل مثبت اختیاری مطابق جدول 1 آماده کنید. برای یک واکنش استاندارد با مساحت کمتر از 5 سانتی‌متر مربع، حجم 50 میکرولیتر است و 50 میکرولیتر تعداد واکنش‌های مثبت در تعداد کل آزمایش در T ضرب می‌شود. بافر جوجه کشی مورد نیاز است. برای نمونه هایی با مساحت سطح بزرگتر، حجم معرف را می توان به تناسب افزایش داد.

جدول 1 بافرهای جوجه کشی TdT برای آزمایش ها و واکنش های کنترل مثبت اختیاری تهیه شده است

[سیستم کنترل منفی]: یک بافر انکوباسیون کنترل بدون آنزیم TdT تهیه شد و آنزیم TdT با ddH2O جایگزین شد.
3.3. بیشتر 100 میکرولیتر بافر تعادلی 1× با کاغذ جاذب در اطراف ناحیه تعادل شسته شد و سپس 50 میکرولیتر بافر انکوباسیون TdT به منطقه 5 سانتی متر مربعی از سلول ها اضافه شد. اجازه ندهید سلول ها خشک شوند. پس از این، اسلاید باید از نور محافظت شود.
3.4. یک ورقه پلاستیکی روی سلول ها قرار دهید تا از توزیع یکنواخت معرف ها اطمینان حاصل کنید و یک حوله کاغذی مرطوب شده با آب را در پایین جعبه مرطوب قرار دهید. اسلایدها در جعبه مرطوب قرار داده شدند و در دمای 37 درجه سانتیگراد به مدت 60 دقیقه انکوبه شدند. جعبه مرطوب را در فویل آلومینیومی بپیچید تا از نور محافظت شود.
[یادداشت]: شیشه پوشش پلاستیکی را می توان قبل از استفاده از وسط نصف کرد. لبه شیشه کاور را برای برداشتن و دستکاری آسان تا کنید.
3.5. ورقه های پلاستیکی برداشته شد و بخش ها در محلول PBS در دمای اتاق به مدت 5 دقیقه انکوبه شدند. سپس مقاطع دو بار با PBS تازه شسته شدند.
3.6. محلول PBS را در اطراف و پشت نمونه با کاغذ صافی به آرامی پاک کنید.
[نکته]: برای کاهش پس‌زمینه، پس از یک‌بار شستشوی لام‌ها با PBS، می‌توان آن‌ها را با PBS حاوی 0.1 درصد تریتون X-100 و 5 میلی‌گرم بر میلی‌لیتر BSA 3 بار و هر بار 5 دقیقه شستشو داد تا نشانگرهای بدون واکنش آزاد شفاف و تمیز باشند.
3.7. نمونه‌ها در یک مخزن رنگ‌آمیزی رنگ‌آمیزی شدند و لام‌ها در یک مخزن رنگ‌آمیزی حاوی محلول PI (1 میکروگرم در میلی‌لیتر، تازه تهیه‌شده و رقیق‌شده با PBS) در تاریکی غوطه‌ور شدند و به مدت 5 دقیقه در دمای اتاق قرار گرفتند. (اختیاری): نمونه ها در یک مخزن رنگ آمیزی رنگ آمیزی شدند و لام ها در یک مخزن رنگ آمیزی حاوی محلول DAPI (2 میکروگرم در میلی لیتر، تازه تهیه شده و رقیق شده با PBS) در تاریکی غوطه ور شدند و به مدت 5 دقیقه در دمای اتاق قرار گرفتند.
3.8.نمونه را بشویید، لام را در آب دیونیزه غوطه ور کنید و به مدت 5 دقیقه در دمای اتاق بگذارید. دو بار در مجموع سه بار شستشو را تکرار کنید.
3.9. آب اضافی روی لام خشک شد و 100 میکرولیتر PBS به ناحیه نمونه اضافه شد تا نمونه مرطوب بماند.
3.10. نمونه ها بلافاصله زیر میکروسکوپ فلورسانس آنالیز شدند و فلورسانس سبز در طول موج 20±520 نانومتر با یک دستگاه فیلتر فلورسانس استاندارد مشاهده شد. فلورسانس قرمز PI در بیش از 620 نانومتر، یا DAPI آبی در 460 نانومتر مشاهده شد. در صورت لزوم، اسلایدها را می توان یک شبه در دمای 4 درجه سانتیگراد در تاریکی نگهداری کرد.
[یادداشت‌ها]: PI/DAPI می‌تواند سلول‌های آپوپتوز و غیرآپوپتوز را قرمز/آبی رنگ کند و فقط در هسته‌های آپوپتوز Alexa Fluor 488-12-DUTP ترکیب شده و فلورسانس سبز موضعی شده است.
4. سلول های سوسپانسیون توسط فلوسیتومتری شناسایی شدند
4.1. 3 ~ 5 × 106 سلول دو بار با PBS توسط سانتریفیوژ (300 × گرم) در دمای 4 درجه سانتیگراد شسته شدند، در 300 گرم در دمای 4 درجه سانتیگراد به مدت 10 دقیقه سانتریفیوژ شدند و سپس در 0.5 میلی لیتر PBS معلق شدند.
4.2. سلول ها تثبیت شدند و 5 میلی لیتر محلول پارافورمالدئید 1 درصد تهیه شده در PBS به آن اضافه شد و به مدت 20 دقیقه روی یخ قرار گرفت.
4.3. سلول ها در 300 × گرم در دمای 4 درجه سانتی گراد به مدت 10 دقیقه سانتریفیوژ شدند و مایع رویی خارج شد و در 5 میلی لیتر PBS معلق شد. شستشو یک بار تکرار شد و سلول ها با 0.5 میلی لیتر PBS معلق شدند.
4.4. سلول‌ها نفوذ کرده و 5 میلی‌لیتر اتانول 70 درصد از قبل سرد شده با یخ اضافه شد و در دمای 20- درجه سانتی‌گراد به مدت 4 ساعت انکوبه شد. سلول ها را می توان در اتانول 70 درصد در دمای 20- درجه سانتیگراد به مدت یک هفته ذخیره کرد، یا سلول ها را می توان با محلول 2/0 درصد تریتون X-100 آماده شده در PBS و در دمای اتاق به مدت 5 دقیقه نفوذپذیر کرد.
4.5. سلول ها در 300 × گرم به مدت 10 دقیقه سانتریفیوژ شدند و در 5 میلی لیتر PBS معلق شدند. سانتریفیوژ تکرار شد و در 1 میلی لیتر PBS معلق شد.
4.6. سلول های 2×106 را به یک لوله میکرو سانتریفیوژ 1.5 میلی لیتری منتقل کنید.
4.7. تعادل در 300 × گرم به مدت 10 دقیقه سانتریفیوژ شد و مایع رویی خارج شد و با 80 میکرولیتر 1× بافر تعادلی معلق شد. به مدت 5 دقیقه در دمای اتاق انکوبه کنید.
4.8. در حین متعادل کردن سلول ها، مخلوط برچسب زنی الکسا فلور 488-12-DUTP روی یخ ذوب شد و بافر انکوباسیون TdT کافی برای همه واکنش ها مطابق جدول 1 تهیه شد. برای یک واکنش استاندارد 2×106 سلول، حجم 50 میکرولیتر و 50 میکرولیتر برابر تعداد واکنش های مورد نیاز در حجم کل بافر TdT است.
4.9. سلول ها به مدت 10 دقیقه در 300 × گرم سانتریفیوژ شدند، مایع رویی خارج شد و رسوب در بافر انکوباسیون 50 میکرولیتری TdT معلق شد و در دمای 37 درجه سانتیگراد به مدت 60 دقیقه، محافظت شده از نور انکوبه شد. سلول ها به آرامی هر 15 دقیقه با یک میکروپیپت معلق شدند.
4.10. واکنش با افزودن 1 میلی لیتر EDTA 20 میلی مولار و مخلوط کردن آرام با یک میکروپیپت خاتمه یافت.
4.11. پس از سانتریفیوژ در 300 گرم به مدت 10 دقیقه، مایع رویی دور ریخته شد و رسوب در 1 میلی لیتر محلول Triton X-100 0.1 درصد تهیه شده در PBS، حاوی 5 میلی گرم بر میلی لیتر BSA مجدداً معلق شد. محلول یک بار تکرار شد و در مجموع دو بار شسته شد.
4.12. مایع رویی توسط سانتریفیوژ در 300 گرم به مدت 10 دقیقه دور ریخته شد و سلول ها در 0.5 میلی لیتر محلول 5 میکروگرم بر میلی لیتر در پی الپی که به تازگی با PBS تهیه شده بود، که حاوی 250 میکروگرم RNase A بدون DNase بود، مجدداً معلق شدند.
4.13. سلول ها در تاریکی به مدت 30 دقیقه در دمای اتاق انکوبه شدند.
4.14. سلول ها با فلوسایتومتری آنالیز شدند و فلورسانس سبز در طول موج 20±520 نانومتر مشاهده شد. فلورسانس قرمز PI در بیش از 620 نانومتر مشاهده شد. PI می تواند سلول های آپوپتوز و غیر آپوپتوز را قرمز رنگ کند و فقط در هسته های آپوپتوز Alexa Fluor 488-12-DUTP گنجانده شده و فلورسانس سبز موضعی شده است.