شرح
کیت تشخیص Mycoplasma qPCR محصولی است که برای تشخیص کیفی آلودگی مایکوپلاسما در منابع مختلف، از جمله مواد خام، بانک‌های سلولی، دانه‌های ویروس، محلول‌های جمع‌آوری سلولی یا ویروسی، و سلول‌های مورد استفاده در درمان‌های بالینی طراحی شده است. این کیت از پروب های فلورسنت Taqman (FAM و VIC) استفاده می کند و از تکنیک های واکنش زنجیره ای پلیمراز چندگانه (PCR) برای شناسایی هدف و کنترل داخلی به طور جداگانه استفاده می کند. برای ویژگی، محدودیت تشخیص و استحکام مطابق با استانداردهای EP <2.6.7> تأیید شده است، که حساسیت، ویژگی، کارایی و ایمنی بالایی را نشان می‌دهد. حد تشخیص برابر یا کمتر از 10 CFU/mL است.
برای استخراج اسید نوکلئیک، این محصول را می توان همراه با کیت آماده سازی نمونه DNA باقیمانده مغناطیسی MolPure® (Cat#18461)، که از روش های استخراج دستی استفاده می کند، استفاده کرد. همچنین، اسیدهای نوکلئیک موجود در نمونه ها را می توان به طور خودکار با استفاده از استخراج کننده خودکار اسید نوکلئیک AutoPure 32A (Cat#80501) و کیت آماده سازی نمونه DNA باقیمانده MolPure® Mag32 FA (Cat#18462) استخراج کرد. توجه به این نکته مهم است که کیت‌های حاوی Cat#18461 و Cat#40619 مورد تایید جامع قرار گرفته‌اند. برای اطلاعات دقیق اعتبار سنجی، لطفا با پشتیبانی فنی ما تماس بگیرید. پس از پیش تیمار نمونه ها برای حذف ناخالصی های مزاحم و به دست آوردن اسیدهای نوکلئیک خالص، یک واکنش qPCR با استفاده از تقویت کننده Real-Time PCR انجام می شود و سیگنال فلورسانس از پروب جمع آوری و آنالیز می شود.
| گربه شماره | 40619ES25 / 40619ES60 |
| اندازه | 25 T / 100 T |
| تشخیص محدود کنید | 10 CFU/ml |
| تشخیص دهید روش | qPCR روش (تقمان فلورسنت) |
| مدت زمان | 4 ساعت |
| فلورسنت کاوشگر | FAM (هدف کانال)；VIC (داخلی کانال) |
| پوشیده شده است مایکوپلاسما | ≥ 100 |
| اعتبار سنجی | تایید شد مطابق به EP <2.6.7> |
اجزاء
| اجزای شماره | نام | 40619ES25 | 40619ES60 |
| 40619-A | بافر واکنش 4×MyqPCR | 250 μL | 1 میلی لیتر |
| 40619-B | MyPrimer & Probe مخلوط کنید | 25 μL | 100 μL |
| 40619-C* | کنترل داخلی (IC) | 25 μL | 100 μL |
| 40619-D** | کنترل مثبت (PC) | 500 μL | 2 میلی لیتر |
| 40619-E*** | رقیق شدن DNA بافر | 1 میلی لیتر | 4×1 میلی لیتر |
| 40619-F**** | آب فوق خالص | 500 μL | 2×1 میلی لیتر |
*IC: داخلی کنترل
** PCS: مثبت کنترل کنید راه حل ، تمرکز است 1000 نسخه در میکرولیتر.
***DNA رقیق سازی بافر: استفاده می شود برای آی سی رقیق شدن و را قالب از NTC و NCS.
**** فوق خالص آب: استفاده شده برای را آماده سازی از qPCR مخلوط کنید.
ذخیره سازی
این محصول باید به مدت 2 سال در دمای -25 ~ -15 درجه سانتیگراد نگهداری شود.
*پس از دریافت کیت، لطفاً بررسی کنید که آیا تمام قطعات کامل هستند یا خیر و بلافاصله آنها را در دمای -25-~-15 درجه سانتیگراد ذخیره کنید. شرایط در صورت عدم انجام آزمایش فورا. لطفاً توجه داشته باشید که 40619-B باید دور از نور نگهداری شود.
دستورالعمل ها
- آماده سازی قبل از آزمایش
1) معرف ها و مواد مورد نیاز را که در آزمایش استفاده می شود آماده کنید.
2) مناسب بودن را تایید کنید ابزار qPCR
این کیت را می توان بر روی انواع ابزار qPCR به شرح زیر استفاده کرد:
- Bio-Rad: CFX96
- Thermo Scientific: 7500 Real-Time PCR System QuantStudio™5.
- روش آزمایش
1) استخراج DNA
توصیه می کنیم استفاده کنید ' کیت آماده سازی نمونه DNA باقیمانده مغناطیسی (Cat#18461ES برای استخراج دستی و Cat#18462ES برای استخراج خودکار) برای استخراج DNA، شما می تواند بازدید کنید ' http://www.yeasenbiotech.com ' برای را
اطلاعات دقیق و خرید
کیت (Cat#40619ES) حاوی یک کنترل داخلی (IC) است. اگر IC را قبل از استخراج DNA به نمونه ها اضافه کنید، می تواند فرآیند کامل (شامل استخراج DNA و واکنش qPCR) را تأیید کند. اگر آی سی را به مخلوط اصلی qPCR اضافه کنید
مستقیم، آی سی فقط به عنوان کنترل qPCR عمل می کند.
آماده سازی مخلوط qPCR 2
- با توجه به مقدار نمونه شامل کنترل مثبت (PCS)، کنترل بدون الگو (NTC)، منفی محلول کنترل (NCS) و نمونه آزمایشی (TS) برای محاسبه تعداد واکنش ها. 2 واکنش را به صورت موازی برای
هر نمونه به طور کلی
* PCS: مثبت کنترل کنید راه حل (NTC): نه قالب کنترل؛NCS:منفی کنترل کنید راه حل TS: تست نمونه وجود دارد است نه نیاز دارند به انجام دهد
را نمونه استخراج برای PCS و NTC، اما NCS و TS هستند مورد نیاز است.
چاه های واکنش (M1) = (1×NCS +). N×TS） × 2
چاه های واکنش (M2) = (1 × PCS + 1 × NTC) × 2
چاه های واکنش (M3) = (1 × PCS + 1 × NTC + N× TS) × 2
- با توجه به طرح آزمایش و جداول زیر مقدار مورد نیاز معرف ها را روی یخ از قبل ذوب کنید.
- مقدار qPCR Mix را با توجه به تعداد واکنش ها محاسبه کنید. لطفاً توجه داشته باشید، اگر کیت برای فعالیت‌های GMP مانند انتشار محصول استفاده می‌شود، استفاده از جدول 1 و 2 را برای آماده‌سازی توصیه می‌کنیم. اگر کیت خواهد شد فقط برای تحقیق استفاده می شود و نیازی به اضافه کردن IC قبل از استخراج پس از ارزیابی نیست، سپس جدول 3 را دنبال کنید
آماده سازی لطفاً توجه داشته باشید که همه M1، M2 و M3 نیستند هستند مورد نیاز است باشد آماده کند.
| جزء | حجم (1×40μL واکنش) | حجم (M1×40μL) |
| 4× بافر واکنش MyqPCR | 10 μL | (M1+2) × 10 μL |
| MyPrimer & Probe مخلوط کنید | 1 μL | (M1+2) ×1 μL |
| ROX | 0.8 μL / 0 μL** | (M1+2) × 0.8 μL / 0 μL |
| آب تصفیه شده | تا 20 μL | تا (M1+2) × 20 μL |
| مجموع | 20 μL | (M1+2) × 20 μL |
جدول 1 سیستم مخلوط qPCR برای M1
* پیکربندی سیستم در جدول 1 است مبتنی بر در را مقدمه که آی سی است اضافه شد قبل از استخراج برای هر دو NCS و TS، بنابراین آن را است نه لازم است
به اضافه کردن آی سی چه زمانی qPCR مخلوط کنید آماده سازی آی سی اضافه کردن روش قبل از استخراج: ابتدا رقیق کنید آی سی توسط 20 بار با DNA رقیق کننده و اضافه کردن 1 میکرولیتر
رقیق شده آی سی به هر کدام 100 میکرولیتر تست کنید نمونه برای را بیشتر استخراج
**این کیت انجام می دهد نه حاوی ROX مرجع رنگ. اگر ROX مرجع رنگ است مورد نیاز است برای را واقعی زمان PCR تقویت کننده ها که شما هستند در حال حاضر با استفاده از 50×ROX مرجع رنگ (Cat#10200ES) است توصیه می شود برای استفاده کنید. در این مورد، اضافه شد حجم است 0.8 میکرولیتر، به عنوان نشان داده شده است در جدول 1. اگر با استفاده از دیگر
مارک ها از ROX محصولات لطفا مراجعه کنید به آنها دستورالعمل ها برای ROX علاوه بر این.اگر نه ROX مرجع رنگ است مورد نیاز، اضافه شد حجم است 0 μL.
| جزء | حجم (1×40μL واکنش) | حجم (M2×40μL) |
| 4× بافر واکنش MyqPCR | 10 μL | (M2+2) × 10 μL |
| MyPrimer & Probe مخلوط کنید | 1 μL | (M2+2) ×1 μL |
| کنترل داخلی (IC) | 1 μL* | (M2+2) ×1 μL / 0 μL |
| ROX | 0.8 μL / 0 μL** | (M2+2) × 0.8 μL / 0 μL |
| تطهیر شد آب | تا 20 μL | تا (M2+2) × 20 μL |
| مجموع | 20 μL | (M2+2) × 20 μL |
جدول 2 سیستم مخلوط qPCR برای M2
* پیکربندی سیستم در جدول 2 است مبتنی بر در را مقدمه که آی سی است نه اضافه شد در PCS و NTC قبل از استخراج، بنابراین آی سی نیاز دارد به باشد اضافه شد در طول qPCR مخلوط کنید آماده سازی آی سی اضافه کردن روش بعد از استخراج: رقیق کنید آی سی توسط 100 بار با DNA رقیق کننده و اضافه کردن 1 میکرولیتر رقیق شده آی سی به
هر کدام qPCR مخلوط کنید سیستم
**این کیت انجام می دهد نه حاوی ROX مرجع رنگ. اگر ROX مرجع رنگ است مورد نیاز است برای را واقعی زمان PCR تقویت کننده ها که شما هستند در حال حاضر با استفاده از 50×ROX مرجع رنگ (Cat#10200ES) است توصیه می شود برای استفاده کنید. در این مورد، اضافه شد حجم است 0.8 میکرولیتر، به عنوان نشان داده شده است در جدول 1. اگر با استفاده از دیگر
مارک ها از ROX محصولات لطفا مراجعه کنید به آنها دستورالعمل ها برای ROX علاوه بر این. اگر نه ROX مرجع رنگ است مورد نیاز، اضافه شد حجم است 0 μL.
| جزء | حجم (1×40μL واکنش) | حجم (M3×40μL) |
| 4× بافر واکنش MyqPCR | 10 μL | (M3+2) × 10 μL |
| MyPrimer & Probe مخلوط کنید | 1 μL | (M3+2) ×1 μL |
| کنترل داخلی (IC) | 1 μL* | (M3+2) ×1 μL / 0 μL |
| ROX | 0.8 μL / 0 μL** | (M3+2) × 0.8 μL / 0 μL |
| تطهیر شد آب | تا 20 μL | تا (M3+2) × 20 μL |
| مجموع | 20 μL | (M3+2) × 20 μL |
جدول 3 سیستم مخلوط qPCR برای M3
* پیکربندی سیستم در جدول 3 است مبتنی بر در را مقدمه که آی سی است نه اضافه شد به نمونه ها قبل از استخراج، بنابراین آی سی نیاز دارد به باشد اضافه شد در طول qPCR مخلوط کنید آماده سازی آی سی اضافه کردن روش بعد از استخراج: رقیق کنید آی سی توسط 100 بار با DNA رقیق کننده و اضافه کردن 1 میکرولیتر به هر کدام qPCR مخلوط کنید
سیستم
**این کیت انجام می دهد نه حاوی ROX مرجع رنگ. اگر ROX مرجع رنگ است مورد نیاز است برای را واقعی زمان PCR تقویت کننده ها که شما هستند در حال حاضر با استفاده از 50×ROX مرجع رنگ (Cat#10200ES) است توصیه می شود برای استفاده کنید. در این مورد، اضافه شد حجم است 0.8 میکرولیتر، به عنوان نشان داده شده است در جدول 1. اگر با استفاده از دیگر
مارک ها از ROX محصولات لطفا مراجعه کنید به آنها دستورالعمل ها برای ROX علاوه بر این. اگر نه ROX مرجع رنگ است مورد نیاز، اضافه شد حجم است 0 μL.
3) اضافه شدن الگوها
- مخلوط qPCR را با تکان دادن کافی مخلوط کنید، با سرعت کم سانتریفیوژ کنید و مایع باقیمانده را از درپوش جمع کنید.
به پایین لوله
- 20 اضافه کنید میکرولیتر qPCR به هر لوله واکنش / چاه مخلوط کنید. لطفاً توجه داشته باشید که مخلوط qPCR مربوطه را به هر کدام اضافه کنید
لوله ها را نمونه برداری کنید و از اضافه کردن خطاها خودداری کنید.
- قالب‌ها را به لوله/چاه‌هایی که حاوی مخلوط qPCR هستند اضافه کنید. برای افزودن الگوها به جدول 4 مراجعه کنید.
| نمونه های تست | در هر لوله یا خوب … |
| TS | 20 μL qPCR Mix+20 μL نمونه ها پس از استخراج |
| NTC | 20 μL qPCR Mix+20 μL DNA رقیق سازی بافر |
| NCS* | 20 μL qPCR Mix+20 میکرولیتر نمونه منفی پس از استخراج* |
| PCS | 20 میکرولیتر qPCR Mix +20 μL مثبت کنترل کنید |
جدول 4 قالب اضافه کردن
*توصیه می کنیم از بافر رقت DNA (40619-E) به عنوان الگوی NCS برای استخراج DNA استفاده کنید.
** کل واکنش حجم در هر کدام لوله/چاه است 40 μL.
*** جلد را لوله درب یا را بشقاب فیلم به اجتناب کنید تاثیر گذار را فلورسانس سیگنال خواندن، لطفا گرفتن مراقبت نه به علامت گذاری کنید را لوله درب یا فیلم
یا حتی مالیدن را فیلم به طور مکرر با الف خراش دهنده
****سانتریفیوژ را واکنش لوله یا بشقاب به طور خلاصه در پایین سرعت بعد از قالب ها اضافه کردن بعد از کافی تکان دادن و مخلوط کردن، تکرار کنید سانتریفیوژ
در پایین سرعت به جمع آوری کنید را مایع از را درب یا دیوار به را پایین اجتناب کنید حباب ها چه زمانی عملیات این خط پایه خواهد شد باشد تحت تاثیر قرار گرفته است اگر را مخلوط کردن
است نه مختلط خب پس این گام است خیلی مهم است به الف خوب آزمایش نتیجه
4) تنظیم برنامه های qPCR
- تنظیمات فایل برنامه
مثال (7500 ابزار سیستم PCR Real-Time و نرم افزار Real-Time PCR نسخه 2.4):
نوع ابزار: 7500 (96 چاه)
نوع آزمایش: منحنی کمی - استاندارد.
شیمی: Taqman® Reagents
سرعت رمپ: استاندارد (2 ساعت برای تکمیل یک دویدن)
- تنظیمات کانال مورد نظر
در "تعریف کنید اهداف و نمونه ها" از "بشقاب راه اندازی، ایجاد کنید الف هدف 1 کانال (FAM) انتخاب کنید FAM به عنوان را گزارش دهی گروه فلورسانس و MGB یا هیچ کدام به عنوان خاموش کردن فلورسانس گروه ایجاد کنید الف هدف 2 کانال (VIC) انتخاب کنید را گزارش دهی فلورسانس گروه به عنوان VIC و را خاموش کردن فلورسانس گروه به عنوان هیچ کدام در "تخصیص اهداف و نمونه ها" از "بشقاب راه اندازی، اگر نه اضافی ROX رنگ است اضافه شده، انتخاب کنید "هیچ"؛ اگر یک اضافی ROX است اضافه شده، انتخاب کنید
ROX.
- تنظیمات برنامه تقویت استاندارد
| S/N | مرحله واکنش | دما | زمان | چرخه(های) |
| 1 | دناتوراسیون اولیه | 95 درجه سانتیگراد | 5 دقیقه | 1 |
| 2 | دناتوره سازی | 95 درجه سانتیگراد | 15 ثانیه |
45 |
| 3 | بازپخت / گسترش (جمع آوری سیگنال فلورسانس) |
62 درجه سانتیگراد |
30 ثانیه |
جدول 5 تنظیمات برنامه تقویت استاندارد
- تنظیم پایه و آستانه:
اصل از خط پایه تنظیم: استفاده کنید را خودکار خط پایه به طور کلی اگر نیاز دارند به تنظیم کنید در کتابچه راهنمای کاربر، انتخاب کنید را چرخه قبل از رشد تصاعدی دوره به عنوان چرخه شروع، و اجتناب از منطقه نوسان اولیه فلورسانس مجموعه چرخه ای را انتخاب کنید که 1-2 سیکل قبل از Ct اولین نمونه تقویت نمایی است.
نقطه پایان
اصل از آستانه تنظیم: به طور کلی از آستانه خودکار استفاده کنید. در صورت نیاز به تنظیم به صورت دستی، آستانه باید باشد مجموعه بالاتر از را منفی نمونه یا را خط پایه سر و صدا، این است به طور کلی مجموعه آستانه در را دیر
مرحله از تقویت نمایی، آستانه نسبی مستقل و مناسب برای هر تونل مورد نیاز است.
5) نتیجه تجزیه و تحلیل
- قضاوت نتیجه برای PCS، NTC و NCS:
اگر آی سی اضافه شود: مشخصات هر نمونه کنترل باید باشد رضایت در جدول 6:
| نمونه کنترل | FAM سیگنال | سیگنال VIC |
| PCS | Ct < 40 و دارای منحنی تقویت آشکار است | Ct < 40 و دارای منحنی تقویت آشکار است |
| NTC | Ct ≥ 40 یا بدون منحنی تقویت واضح | Ct < 40 و دارای منحنی تقویت آشکار است |
| NCS | Ct ≥ 40 یا بدون منحنی تقویت واضح | Ct < 40 و دارای منحنی تقویت آشکار است |
جدول 6 نتیجه قضاوت از PCS، NTC و NCS
اگر آی سی اضافه نشده باشد: هر نمونه کنترل کیفیت باید با مشخصات ستون سیگنال FAM در جدول 6 مطابقت داشته باشد.
نیاز به تجزیه و تحلیل کانال VIC
- قضاوت نتیجه برای TS
پیش نیاز: آن را است برای تعیین اینکه آیا PCS، NTC و NCS مشخصات را پاس کرد در جدول 6 قبل از TS تجزیه و تحلیل نتایج اگر گذشت، پس می تواند را ادامه دهید مرحله بعدی اگر نه گذشت، را TS نتایج می نه باشد قابل اعتماد، و
دلیل آن باید بررسی شود
اگر آی سی اضافه شد: نتایج مربوطه را پیدا کنید قضاوت با توجه به اطلاعات نتیجه FAM و VIC در جدول 7:
| FAM سیگنال | سیگنال VIC | نتیجه قضاوت |
| Ct<40 و واضح است منحنی تقویت | Ct<40 و دارای منحنی تقویت آشکار است | مثبت |
| Ct≥40 یا بدون منحنی تقویت واضح | یک بازداری وجود دارد، آزمایش باید تکرار شود | |
| Ct≥40 یا مشخص نیست منحنی تقویت | Ct<40 و دارای منحنی تقویت آشکار است | منفی |
| Ct≥40 یا بدون منحنی تقویت واضح | یک بازداری وجود دارد، آزمایش باید تکرار شود |
جدول 7: نتیجه قضاوت از TS (IC اضافه شد)
*اگر وجود دارد است مهار برای VIC سیگنال، درمان است مورد نیاز است به از بین بردن را مهار کننده ها یا تکرار کنید را تست کنید.
اگر آی سی اضافه نشده است: نتایج مربوطه را پیدا کنید قضاوت بر اساس اطلاعات نتیجه FAM در جدول 8 ، و نیازی به تجزیه و تحلیل نیست سیگنال VIC
| سیگنال FAM | نتیجه قضاوت |
| Ct<40 و دارای منحنی تقویت آشکار است | مثبت |
| Ct≥40 یا بدون منحنی تقویت واضح | منفی |
جدول 8: نتیجه قضاوت از TS (IC نه اضافه شد)
یادداشت ها
- لطفاً قبل از استفاده از این کیت، این دفترچه راهنما را به دقت بخوانید. آزمایش باید به شیوه ای استاندارد انجام شود، از جمله جابجایی نمونه، آماده سازی سیستم واکنش و افزودن نمونه.
- در صورت امکان عملیات افزودن نمونه و آماده سازی معرف ها را روی یخ ادامه دهید.
- قبل از استفاده برای هر یک از معرف ها ورتکس کرده و خوب مخلوط کنید.
- لطفاً با کت های آزمایشگاهی و دستکش های یکبار مصرف کار کنید امنیت شما
- این محصول فقط برای استفاده تحقیقاتی است.
[1] ژائو اف، وانگ ایکس، لی یی، چن ایکس، گنگ زی، ژانگ سی.اثرات مکمل های غذایی با اپی گالوکاتچین گالات بر کیفیت گوشت و ظرفیت آنتی اکسیدانی عضلانی جوجه های گوشتی در معرض استرس گرمایی حاد. حیوانات (بازل). 2021؛ 11 (11): 3296. منتشر شده در 18 نوامبر 2021. doi:10.3390/ani11113296(IF:2.752)
پرداخت و امنیت
اطلاعات پرداخت شما با اطمینان پردازش می شود. ما جزئیات کارت اعتباری را ذخیره نمی کنیم و به اطلاعات کارت اعتباری شما دسترسی نداریم.
تحقیق
شما همچنین ممکن است دوست داشته باشید
پرسش
این محصول فقط برای اهداف تحقیقاتی است و برای استفاده درمانی یا تشخیصی در انسان یا حیوانات در نظر گرفته نشده است. محصولات و محتوا توسط پتنت ها، علائم تجاری، و حق چاپ متعلق به Yeasen Biotechnology محافظت می شوند. نمادهای علامت تجاری نشان دهنده کشور مبدا هستند، نه لزوما ثبت در همه مناطق.
برخی از برنامه‌های کاربردی ممکن است به حقوق مالکیت معنوی شخص ثالث دیگری نیاز داشته باشند.
Yeasen به علم اخلاق اختصاص داده شده است و معتقد است که تحقیقات ما باید به سؤالات مهم و در عین حال اطمینان از ایمنی و استانداردهای اخلاقی بپردازد.