پلی‌برن (هگزادیمترین برمید)، همچنین به عنوان پلی‌برن شناخته می‌شود، یک پلیمر کاتیونی است که معمولاً در آزمایش‌های انتقال DNA با سلول‌های پستانداران برای افزایش کارایی انتقال لیپوزوم‌ها استفاده می‌شود. این به طور گسترده در انتقال ژن با واسطه رتروویروس و انتقال ژن با واسطه لنتی ویروس استفاده می شود. مکانیسم اثر ممکن است شامل خنثی کردن اسید سیالیک در سطح سلول، تسهیل جذب با غلبه بر دافعه الکترواستاتیک با ذرات ویروس باشد. پلی برن همچنین به عنوان یک ضد انعقاد (آنتاگونیست هپارین) شناخته می شود و به طور مکرر در تولید گلبول های قرمز تجمع یافته غیر اختصاصی استفاده می شود. علاوه بر این، در توالی یابی پروتئین، دوزهای پایین پلی برن به طور قابل توجهی تجزیه پپتیدها را در تجزیه و تحلیل توالی یابی خودکار بهبود می بخشد. افزودن پلی برن به غشاهای PVDF نیز می تواند میل غشا را افزایش دهد.

مشخصات

این محصول به شکل محلول ارائه می شود و پودر در 0.9% NaCl برای ایجاد محلول 10 میلی گرم در میلی لیتر، بازسازی می شود که سپس با استفاده از فیلتر 0.22 میکرومتر استریل می شود. معمولاً برای استفاده در نسبت 1:1000-1:2000 رقیق می شود، با نسبت رقت های خاص بسته به نوع سلول، همانطور که در مقالات مربوطه ذکر شده است.

حمل و نقل و ذخیره سازی

حمل و نگهداری در دمای -20 درجه سانتیگراد با ماندگاری 2 سال توصیه می شود. توصیه می‌شود برای جلوگیری از تکرار چرخه‌های انجماد و ذوب به مقدار کافی و ذخیره شود.

موارد احتیاط:

1. برای ایمنی و سلامتی از لباس های آزمایشگاهی و دستکش های یکبار مصرف استفاده کنید.

2. این محصول فقط برای اهداف تحقیقاتی است.

مراحل عملیاتی

(برای مرجع، غلظت های خاص ممکن است متفاوت باشد، به ادبیات مربوطه مراجعه کنید):

توجه: پلی‌برن ممکن است سمیت قابل توجهی برای سلول‌های خاص (مانند نورون‌های تمایز یافته نهایی، سلول‌های DC) نشان دهد و آزمایش سمیت برای استفاده اولیه توصیه می‌شود.

آزمایش 1: عفونت رتروویروسی

1. تهیه انبار رتروویروس نوترکیب: سلول های کشت حاوی تک لایه سلول های بسته بندی رتروویروس ترانسفکشن در یک ظرف 100 میلی متری با محیط رشد 5 میلی لیتری (سرم 5 درصد). پس از 24 ساعت، محیط کشت را بردارید و آن را از طریق فیلتر 0.45 میکرومتر فیلتر کنید.

2. کشت سلول ها برای عفونت: در یک ظرف 100 میلی متری، 10 میلی لیتر محیط رشد کامل با تراکم سلولی 5× اضافه کنید.10⁵ در هر ظرف

3. عفونت ویروسی: پس از 24 ساعت کشت سلولی، محیط کشت کامل را خارج کنید. سلول ها را با 2 میلی لیتر مایع رویی ویروس حاوی پلی برن (غلظت نهایی: 5-10 میکروگرم بر میلی لیتر) در دمای 37 درجه سانتی گراد به مدت 6-3 ساعت آلوده کنید.

4. جمع آوری ذرات ویروس: 8 میلی لیتر محیط رشد کامل اضافه کنید. پس از 2-3 روز از کشت، محیط کشت را جمع آوری کنید تا ذرات ویروس به دست آید.

آزمایش 2: انتقال

1. سلول های کشت در محیط رشد کامل با تراکم سلولی تقریباً 50 درصد.

2. پس از 18 تا 24 ساعت کشت سلولی، مخلوطی از محیط رشد DNA- پلی برن تهیه کنید. محیط رشد کامل را اضافه کنید (2 میلی لیتر برای یک ظرف 60 میلی متری، 3 میلی لیتر برای یک ظرف 100 میلی متری) و از قبل تا دمای 37 درجه سانتی گراد گرم کنید. 10 نانوگرم تا 10 میکروگرم پلاسمید را به آرامی مخلوط کنید. پلی برن را به غلظت نهایی 5-10 میکروگرم در میلی لیتر اضافه کنید. به آرامی مخلوط کنید. هر جزء باید به ترتیب مشخص شده اضافه شود.

3. محیط کشت را برداشته و محیط رشد DNA- محلول پلی برن را به مدت 6-20 ساعت در دمای 37 درجه سانتی گراد به سلول ها اضافه کنید. هر 1.5 ساعت در 6 ساعت اول کشت سلولی به آرامی مخلوط کنید.

4. محلول پلی برن محیط رشد DNA را بردارید. سلول ها را با محلول شوک DMSO (15% DMSO در 1× HBSS) بپوشانید.برای اطمینان از توزیع یکنواخت، هر بار که محلول اضافه می شود، ظرف کشت را به آرامی به مدت 10 ثانیه تکان دهید. سلول ها را در دمای 37 درجه سانتی گراد به مدت 4 دقیقه انکوبه کنید.

5. بلافاصله محلول شوک DMSO را خارج کرده و سلول ها را دو بار با محیط رشد کامل به آرامی بشویید. برای ظرف 60 میلی متری هر بار با 5 میلی لیتر محیط کشت و برای ظرف 100 میلی متری هر بار با 10 میلی لیتر محیط کشت بشویید.

6. محیط رشد کامل را به سلول ها اضافه کنید.

7. بیان پروتئین: پس از 24-72 ساعت کشت، سلول ها را برای تجزیه و تحلیل بیان پروتئین در صورت نیاز جمع آوری کنید.

انتخاب سلول: پس از 24 تا 72 ساعت کشت، بر اساس وضعیت سلولی، به محیط انتخاب تازه بروید و انتخاب سلول را ادامه دهید.