شرح
معرف ترانسفکشن پلی اتیلن ایمین خطی شده PEI 25000 یک پلیمر کاتیونی بسیار باردار است که به راحتی به مولکول های اسید نوکلئیک با بار منفی متصل می شود، یک کمپلکس تشکیل می دهد و به کمپلکس اجازه ورود به سلول را می دهد. معرف ترانسفکشن یک معرف ترانسفکشن گذرا با سمیت سلولی کم، راندمان ترانسفکشن بالا و راندمان بیان ژن بالا در سلول هایی مانند HEK293 و CHO است. تأیید شده است که معرف ترانسفکشن خطی PEI به طور گسترده برای انواع رده های سلولی از جمله HEK-293، HEK293T، CHO-K1، COS-1، COS-7، NIH/3T3، Sf9، HepG2 و Hela، و غیره قابل استفاده است.
مشخصات
| نام | پلی اتیلنیمین خطی (PEI) MW25000 |
| شماره CAS | 9002-98-6, 26913-06-4 |
| فرمول مولکولی | (CH2CH2NH)n |
| وزن مولکولی | 25000 |
| ظاهر | سفید یا پودر زرد روشن |
| نقطه ذوب | 73~75 ℃ |
| حلالیت | محلول در آب گرم، آب سرد با pH پایین، متانول و اتانول. نامحلول در بنزن، اتر و استون |
| ساختار |
|
حمل و نقل و ذخیره سازی
محصول در دمای اتاق ارسال می شود و پودر را می توان در دمای 2-8 درجه سانتیگراد به مدت دو سال نگهداری کرد. محلول موجود در دمای 8-2 درجه سانتیگراد به مدت 3 ماه نگهداری می شود.
هشدارها
1) پس از اینکه محلول PEI تهیه شده از 20- درجه سانتیگراد خارج شد و ذوب شد، می توان آن را در یخچال 4 درجه سانتیگراد نگهداری کرد و نباید دوباره منجمد شود.
2) برای اکثر سلول ها، 3.0 میکرولیتر از معرف ترانسفکشن PEI در هر 1 میکروگرم DNA می تواند بازده انتقال بالایی را به دست آورد. همچنین می توانید سعی کنید از حجم 1.5 تا 4 میکرولیتر از معرف ترانسفکشن خطی PEI در هر 1 میکروگرم DNA برای بهینه سازی استفاده کنید.
3) برای ایمنی و سلامتی خود، لطفاً یک کت آزمایشگاه، دستکش یکبار مصرف و یک هود بخور برای کار بپوشید.
4) این محصول فقط برای اهداف تحقیقاتی علمی است، نه برای استفاده انسانی.
آماده سازی محلول استوک (1 میلی گرم در میلی لیتر)
1. مواد
PEI 25000، آب/آب تزریقی Milli-Q® (WFI) یا آب درجه بیولوژیکی مشابه، اسید کلریدریک 12 مول در لیتر (HCl)، 10 مول در لیتر هیدروکسید سدیم (NaOH)، فیلتر استریل خلاء PES یکبار مصرف، فیلتر استریل HDPE یا بطری پلی پروپیلن.
2. محلول استوک (1 میلی گرم در میلی لیتر) آماده کنید
1) در یک بشر شیشه ای 1 لیتری، 1 گرم پودر PEI 25000 را به 900 میلی لیتر آب فوق خالص Milli-Q یا دیگر آب بیولوژیکی معادل اضافه کنید و به طور یکنواخت روی یک همزن مغناطیسی هم بزنید تا یک گرداب کوچک ایجاد شود.
2) اسید کلریدریک (12 mol/L) را به صورت قطره ای اضافه کنید و در حین هم زدن pH را تا PH<2.0 تنظیم کنید.
3) روی ظرف را بپوشانید و 3 ساعت هم بزنید تا کاملا حل شود. PH کمتر از 2.0 را در طول فرآیند حفظ کنید.
【نکته】: ممکن است ذرات فیبری کوچکی وجود داشته باشند که قابل حل نباشند، که یک پدیده طبیعی است.
4) NaOH (10 mol/L) را به صورت قطره ای اضافه کنید و در حین هم زدن pH را تنظیم کنید تا به 6.9 ~ 7.1 برسد.
5) محلول را به یک استوانه مدرج منتقل کنید و آب را به 1 لیتر اضافه کنید.
6) با فیلتر خلاء 0.1-0.2 میکرومتر PES فیلتر و استریل کنید تا محلول ذخیره 1 میلی گرم بر میلی لیتر به دست آید.
7) به مقدار لازم و در دمای 20- درجه سانتیگراد به مدت 1 سال نگهداری شود.
【نکته】: پس از ذوب مجدد محلول نگهداری، می توان آن را در دمای 4 درجه سانتی گراد نگهداری کرد و به مدت 2 هفته پایدار است، اما نباید دوباره منجمد شود.
روش ترانسفکشن (به عنوان مثال در نظر گرفتن صفحه 6 چاهی)
1. تلقیح سلولی: به منظور بهبود راندمان ترانسفکشن، توصیه می شود که سلول ها یک روز قبل از ترانسفکشن تلقیح شوند و تراکم سلولی در زمان ترانسفکشن ترجیحاً 70 تا 80 درصد باشد.
2. کمپلکس DNA-PEI را آماده کنید: کمپلکس معرف ترانسفکشن اسید نوکلئیک DNA-PEI را طبق سیستم زیر آماده کنید:
1) برای هر چاه سلول، 2 میکروگرم از DNA هدف را با 100 میکرولیتر محیط بدون سرم رقیق کنید و کاملاً مخلوط کنید تا یک رقت DNA تشکیل شود.
[توجه]: Opti-MEM یا ddH2O برای رقیق کننده بدون سرم توصیه می شود
2) بلافاصله 5 میکرولیتر از معرف ترانسفکشن PEI 25000 را به 100 میکرولیتر رقیق کننده DNA اضافه کنید، به مدت 10 ثانیه گرداب کنید و خوب مخلوط کنید.
3) در دمای اتاق به مدت 10-25 دقیقه انکوبه کنید تا کمپلکس معرف ترانسفکشن اسید نوکلئیک کاتیونی DNA-PEI تشکیل شود.
3. سلول های ترانسفکت شده:
1) در طول تشکیل کمپلکس، محیط رشد سلولی را بردارید و 2 میلی لیتر از محیط کامل از قبل گرم شده تازه را به هر چاهک اضافه کنید.
2) 100 میکرولیتر کمپلکس اسید نوکلئیک DNA-PEI-PEI را مستقیماً به سلول ها اضافه کنید، صفحه کشت را تکان دهید و به آرامی مخلوط کنید.
3) در انکوباتور 37 درجه سانتی گراد و 5% CO2 کشت کنید و بیان ژن را می توان به محض 7 ساعت پس از ترانسفکشن تشخیص داد. لطفا زمان مناسب تست را خودتان تعیین کنید.
4. غربالگری چرخشی ثابت (اختیاری)
24 ساعت پس از ترانسفکشن، سلول ها در محیط رشد تازه کشت شدند (سلول ها را بیش از 10 بار رقیق کنید)، و یک شبه در دمای 37 درجه سانتی گراد در انکوباتور CO2 5٪ انکوبه شدند. روز بعد، یک داروی غربالگری مطابق با ژن مقاومت به ترانسفکشن اضافه شد. کلون های مقاوم به دارو را می توان در حدود 1 تا 2 هفته غربالگری کرد. در این دوره، محیط رشد حاوی داروهای غربالگری باید به طور مکرر جایگزین شود.
دوز ترانسفکشن برای عروق مختلف کشت سلولی (فقط برای مرجع):
| فرهنگ کشتی | گشت و گذار. منطقه در هر چاه*(cm2) | DNA (μg) | ترانسفکشن معرف (μL) | جلد از رقیق شدن متوسط ** (μL) | جلد از آبکاری متوسط |
| 96-خوب | 0.3 | 0.1 | 0.1 | 10 | 100 میکرولیتر |
| 48-چاه | 0.7 | 0.2 | 0.3 | 20 | 200 میکرولیتر |
| 24-خوب | 1.9 | 0.5 | 1 | 50 | 500 میکرولیتر |
| 12-چاه | 3.8 | 1 | 2 | 50 | 1 میلی لیتر |
| 6-چاه | 10 | 2 | 4 | 100 | 2 میلی لیتر |
| فلاسک 25 سانتی متر مربع | 21 | 4 | 8 | 200 | 4 میلی لیتر |
| فلاسک 75 سانتی متر مربع | 58 | 10 | 20 | 500 | 10 میلی لیتر |
استنادها و مراجع:
[1] Qin J، Cai Y، Xu Z، و همکاران. مکانیسم مولکولی آگونیسم و آگونیسم معکوس در گیرنده گرلین Nat Commun. 2022؛ 13 (1): 300. منتشر شده در 13 ژانویه 2022. doi:10.1038/s41467-022-27975-9(IF: 14.919)
[2] Wang Y، Chen J، Gao WQ، Yang R. METTL14 با مهار THBS1 از طریق مکانیسم وابسته به m6A-YTHDF2، تومورزایی پروستات را ترویج می‌کند. کشف مرگ سلولی. 2022؛ 8 (1): 143. منتشر شده در 30 مارس 2022. doi:10.1038/s41420-022-00939-0(IF: 5.241)
پرداخت و امنیت
اطلاعات پرداخت شما با اطمینان پردازش می شود. ما جزئیات کارت اعتباری را ذخیره نمی کنیم و به اطلاعات کارت اعتباری شما دسترسی نداریم.
تحقیق
شما همچنین ممکن است دوست داشته باشید
پرسش
این محصول فقط برای اهداف تحقیقاتی است و برای استفاده درمانی یا تشخیصی در انسان یا حیوانات در نظر گرفته نشده است. محصولات و محتوا توسط پتنت ها، علائم تجاری، و حق چاپ متعلق به Yeasen Biotechnology محافظت می شوند. نمادهای علامت تجاری نشان دهنده کشور مبدا هستند، نه لزوما ثبت در همه مناطق.
برخی از برنامه‌های کاربردی ممکن است به حقوق مالکیت معنوی شخص ثالث دیگری نیاز داشته باشند.
Yeasen به علم اخلاق اختصاص داده شده است و معتقد است که تحقیقات ما باید به سؤالات مهم و در عین حال اطمینان از ایمنی و استانداردهای اخلاقی بپردازد.