ورو کیت تشخیص باقیمانده DNA سلول میزبان برای تجزیه و تحلیل کمی باقیمانده DNA سلول میزبان Vero در نمونه های میانی، محصولات نیمه تمام و نهایی محصولات بیولوژیکی مختلف استفاده می شود.

این کیت از پروب فلورسنت Taqman و روش واکنش زنجیره‌ای پلیمراز (PCR) استفاده می‌کند که حداقل حد تشخیص سطح fg را دارد و می‌تواند به‌طور خاص و سریع DNA سلول Vero باقیمانده را تشخیص دهد. کیت باید همراه با کیت آماده سازی نمونه DNA باقیمانده (Cat# 18461ES) استفاده شود.

محصول اجزاء

^*آی سی: کنترل داخلی

حمل و نقل و ذخیره سازی

1. حمل بر روی یخ خشک و در دمای 20- درجه سانتی گراد نگهداری می شود برای 2 سال

2. لطفا پس از دریافت کالا، بلافاصله آن را بررسی و در دمای نگهداری مربوطه نگهداری نمایید.

هشدارها

1. لطفاً قبل از استفاده از این معرف، این راهنما را به دقت بخوانید و آزمایش باید استاندارد شود، از جمله جابجایی نمونه، آماده‌سازی سیستم واکنش و افزودن نمونه.

2. افزودن نمونه ها و تهیه محلول ها بهتر است روی یخ انجام شود.

3. قبل از استفاده، اطمینان حاصل کنید که هر جزء کاملاً ورتکس شده و با سرعت کم سانتریفیوژ شده است.

4. برای ایمنی و سلامتی خود، لطفا از کت های آزمایشگاهی و دستکش های یکبار مصرف برای عمل استفاده کنید.

5. این محصول فقط برای استفاده تحقیقاتی است!

مدل های ابزار قابل اجرا

شامل اما نه محدود به:

بیو راد: ماژول نوری CFX96.

Thermo Scientific: ABI 7500; ABI Quant Studio 5; ABI Step OnePlus.

با استفاده از دستورالعمل

1. ورو رقت استاندارد DNA و تهیه منحنی استاندارد

Vero کنترل DNA با استفاده از بافر رقت DNA ارائه شده در کیت، گرادیان رقیق شد. و غلظت رقت 300 pg/μL، 30 pg/μL، 3 pg/μL، 300 fg/μL، 30 fg/μL، 3 است. fg/μL.

دستورالعمل های دقیق را در زیر مشاهده کنید:

1.1 ذوب کنید ورو کنترل DNA و بافر رقت DNA روی یخ. پس از ذوب کامل، به آرامی ورتکس کنید تا مخلوط شود و با سرعت کم به مدت 10 ثانیه سانتریفیوژ کنید.

1.2 شش را بیرون بیاورید لوله های 1.5 میلی لیتری را تمیز کنید که با 3 نانوگرم در میکرولیتر، ①، ②، ③، ④، ⑤، ⑥ مشخص شده اند.

1.3 90 میکرولیتر بافر رقت DNA و 10 میکرولیتر Vero اضافه کنید کنترل DNA به 1.لوله میکروفیوژ 5 میلی لیتری با برچسب 3 نانوگرم در میکرولیتر، و رقیق می شود 3 نانوگرم در میکرولیتر مخلوط کنید و سپس به مدت 10 ثانیه سانتریفیوژ کنید. استاندارد DNA رقیق شده را زیر بسته بندی کنید و می توان آن را در کوتاه مدت (حداکثر 3 ماه) در دمای 80- درجه سانتی گراد نگهداری کرد.

1.4 90 میکرولیتر بافر رقت DNA را به بافر دیگر اضافه کنید لوله ها، سپس روش زیر را برای رقت های سریال دنبال کنید.

[یادداشت ها]:

1. سه چاه تکرار برای هر غلظت مورد نیاز است. محدوده تشخیص 3 است fg/μL-300pg/μL و در صورت نیاز می توان این محدوده را افزایش داد.

2. برای کاهش تعداد دفعات انجماد-ذوب مجدد و جلوگیری از آلودگی، توصیه می شود که کنترل DNA را ذخیره کنید برای اولین بار در مقادیر کمی در -80 درجه سانتیگراد.

3. پس از ذوب، بافر رقت DNA می تواند در دمای 2-8 درجه سانتیگراد نگهداری شود به مدت 7 روز، در صورت عدم استفاده طولانی مدت، لطفا در دمای -20 درجه سانتیگراد نگهداری شود.

4. مطمئن شوید که قالب کاملا مخلوط شده است، مخلوط را به آرامی به مدت 15 ثانیه تا 1 دقیقه تکان دهید. برای هر رقت شیب.

2. آماده سازی کنترل بازیابی استخراج (ERC).

غلظت را تنظیم کنید از Vero DNA در ERC در صورت نیاز (نمونه ERC به عنوان مثال با 3 pg/μL DNA تهیه شد، به شرح زیر:

2.1 100 میکرولیتر نمونه آزمایشی را به یک لوله تمیز 1.5 میلی لیتری اضافه کنید، سپس 10 میکرولیتر 3pg/μL Vero اضافه کنید. استاندارد DNA (③) و با علامت ERC به خوبی مخلوط کنید.

2.2 استخراج DNA نمونه ERC را انجام دهید همراه با نمونه های آزمایشی برای تهیه ERC خالص نمونه

3. آماده سازی نمونه کنترل مثبت (PCS) (اختیاری)

غلظت را تنظیم کنید از Vero DNA در PCS در صورت نیاز (PCS به عنوان مثال با 3 pg/μL DNA تهیه شد، به شرح زیر:

3.1 100 میکرولیتر 3 pg/μL Vero اضافه کنید استاندارد DNA (③) در یک لوله تمیز 1.5 میلی لیتری، سپس به عنوان PCS علامت گذاری شده است.

3.2 استخراج DNA PCS را انجام دهید همراه با نمونه های آزمایشی برای تهیه PCS خالص شده.

4. منفی آماده سازی محلول کنترل (NCS).

کنترل منفی را در آزمایش تنظیم کنید، مراحل عملیات خاص به شرح زیر است:

4.1 100 میکرولیتر اضافه کنید ماتریس نمونه (یا بافر رقت DNA) در یک لوله تمیز 1.5 میلی لیتری، سپس به عنوان NCS علامت گذاری شده است.

4.2 استخراج DNA نمونه NCS را همراه با نمونه های آزمایشی برای آماده سازی نمونه NCS خالص شده انجام دهید.

5. بدون آماده سازی کنترل الگو (NTC).

الگوی بدون را تنظیم کنید کنترل در آزمایش، مراحل عملیات خاص به شرح زیر است:

5.1 NTC نیازی به پیش تیمار نمونه ندارد و می توان آن را در مرحله تشخیص qPCR محتوای DNA باقیمانده پیکربندی کرد.

5.2 نمونه NTC در هر لوله یا چاه 20 است μL مخلوط کنید (یعنی 16 μL مخلوط Vero qPCR + 4 میکرولیتر مخلوط پرایمر و پروب Vero) + 20 میکرولیتر بافر رقت DNA توصیه می شود که سه چاه تکراری را پیکربندی کنید.

6. سیستم واکنش PCR

[یادداشت ها]:

1. حجم کل واکنش PCR را با تعداد واکنش ها محاسبه کنید: qPCR Mix =(تعداد واکنش ها+2) × (16+4) میکرولیتر (شامل تلفات دو چاه واکنش). بیش از سه تکرار برای هر نمونه در آزمایش توصیه می شود.

2. پس از بستن لوله یا آب بندی صفحه، لوله یا صفحه واکنش را با سرعت کم به مدت 10 ثانیه سانتریفیوژ کنید. پس از تکان دادن و مخلوط کردن کافی به مدت 5 ثانیه، سانتریفیوژ را تکرار کنید تا مایع از درب یا دیواره به پایین جمع شود. از ایجاد حباب در حین کار اجتناب کنید.

برای تنظیم صفحه توصیه شده به جدول زیر مراجعه کنید:

چیدمان بشقاب شامل: 1 NTC (شماره قالب کنترل)، 1 NCS (کنترل منفی راه حل) 6 STD (منحنی استاندارد 6 غلظت استاندارد)، 3 TS (نمونه های آزمایشی)، 3 ERC (کنترل بازیابی استخراج)، 1 PCS (نمونه کنترل مثبت).سه چاه تکرار برای هر نمونه.

7. دستورالعمل های راه اندازی برای یک ابزار PCR (روش 2 مرحله ای)

دستورالعمل های زیر فقط برای دستگاه Thermo ABI 7500 qPCR اعمال می شود (نرم افزار نسخه 2.0). اگر از ابزار دیگری استفاده می کنید، برای دستورالعمل های راه اندازی به راهنمای ابزار قابل اجرا مراجعه کنید.

7.1 یک آزمایش جدید ایجاد کنید، الگوی کمیت مطلق یا تعریف شده توسط کاربر را انتخاب کنید.

7.2 در رابط "تعریف" و "هدف"، یک هدف را اضافه کنید که به عنوان FAM نامگذاری شده است، گزارشگر را به عنوان "FAM" و خاموش کننده را به عنوان "هیچ" انتخاب کنید.

7.3 در بخش "نمونه ها"، تمام اطلاعات نمونه ها را به نوبه خود اضافه کنید. سپس چاه ها را انتخاب کنید، هدف و نمونه ها را به ترتیب انتخاب کنید. وظیفه Vero را تنظیم کنید استاندارد DNA به عنوان استاندارد، و مقادیر 300000، 30000، 3000، 300، 30، 3 را تعیین می کند. (واحد غلظت DNA در هر چاه fg/μL است) در ستون Quantity و نام چاه ها را STD 1, STD 2, STD 3, STD 4, STD 5, STD 6، به ترتیب. وظیفه NTC را به عنوان NTC تنظیم کنید. NCS، TS، ERC را تنظیم کنید و PCS به عنوان ناشناخته، و آنها را مطابق با طرح صفحه بالا نامگذاری کرد. سپس روی next کلیک کنید.

7.4 برنامه تقویت را تنظیم کنید: حجم واکنش را 40 میکرولیتر تنظیم کنید.

8. تجزیه و تحلیل نتایج qPCR

8.1 سیستم به طور خودکار آستانه را در پنل Amplification Plot تجزیه و تحلیل می دهد. آستانه ارائه شده توسط سیستم گاهی اوقات خیلی نزدیک به خط پایه است و در نتیجه تفاوت زیادی در Ct بین چاهک های تکراری ایجاد می شود. می توانید به صورت دستی آستانه را در یک موقعیت مناسب تنظیم کنید و روی آنالیز کلیک کنید. سپس می توانید در ابتدا بررسی کنید که آیا منحنی تقویت در Plot Multicomponent نرمال است یا خیر.

8.2 در تب Result Analysis، نمودار منحنی استاندارد را مرور کنید. مقادیر Slope، Y-intercept، R2 را بررسی کنید و کارایی برای یک منحنی استاندارد معمولی، R²> 0.99; 90%≤Eff%≤110%.

8.3 در "مشاهده جدول خوب" در بخش تجزیه و تحلیل، غلظت هر نمونه به صورت کمی نشان داده شده است، واحد fg/μL است، واحدها را می توان به pg/μL تبدیل کرد. یا pg/ml در گزارش سنجش.

دفترچه راهنما