از کیت تشخیص لنتی ویروس (RCL) با قابلیت تکرار استفاده می شود برای تشخیص کمی لنتی ویروس های در حال تکثیر که ممکن است در یک رخ دهد انواع محصولات سلولی مرتبط با لنتی ویروس بردار خطرات بالقوه

این کیت پرایمرهای خاصی را برای توالی ژن VSV-G پروتئین های پوششی لنتی ویروسی. و تقمان را می پذیرد  پروب فلورسنت و روش واکنش زنجیره ای پلیمراز (PCR) که دارای حد تشخیص سطح 1 کپی در میکرولیتر است و می تواند به طور خاص و سریع تشخیص دهد خطر لنتی ویروس دارای قابلیت تکثیر کیت نیاز دارد برای استفاده همراه با کیت آماده سازی نمونه DNA باقیمانده (Cat# 18461ES).

اجزاء

* آی سی： داخلی کنترل کنید.

ذخیره سازی

این محصول باید در دمای -25 ~ -15 درجه سانتیگراد نگهداری شود برای 2 سال

هر دو 41311-A و 41311-B باید در محافظت از نور نگهداری شوند.

قابل اجرا ساز مدل ها

شامل اما نه محدود به: Bio-Rad: CFX96 Optic Module; Thermo Scientific: ABI 7500; ABI Quant Studio 5; ABI Step OnePlus.

دستورالعمل ها

1. DNA RCL استاندارد رقیق شدن و استاندارد منحنی آماده سازی

کنترل DNA RCL با گرادیان با استفاده از بافر رقت DNA ارائه شده در کیت رقیق شد* و رقیق سازی غلظت 5×10E7 است کپی/μL، 5×10E6 کپی/μL، 5×10E5 کپی/μL، 5×10E4 کپی/μL، 5×10E3 کپی/μL، 5×10E2 کپی/μL، 5×10E1 کپی/μL.

دستورالعمل های دقیق را در زیر مشاهده کنید:

1) کنترل DNA RCL و بافر رقت DNA را روی یخ ذوب کنید. پس از ذوب کامل، گرداب به آرامی به مخلوط کردن، و با سرعت کم به مدت 10 ثانیه سانتریفیوژ کنید.

2) هفت لوله تمیز 1.5 میلی لیتری را که با Std0، Std1، Std2، Std3، Std4، Std5، Std6 مشخص شده اند، خارج کنید.

3) 90 اضافه کنید میکرولیتر بافر رقت DNA و 10 میکرولیتر کنترل DNA RCL به لوله میکروفیوژ 1.5 میلی لیتری با برچسب Std0، یعنی   تا 5×10E7 رقیق شود کپی/μL. مخلوط کنید و سپس به مدت 10 ثانیه سانتریفیوژ کنید. زیر بسته بندی استاندارد DNA رقیق شده و می تواند باشد ذخیره شده در کوتاه مدت (حداکثر 3 ماه) در -25~-15℃** .لطفاً از انجماد و ذوب مکرر خودداری کنید.

4) 90 اضافه کنید میکرولیتر بافر رقت DNA به لوله های دیگر *** ، سپس روش زیر را برای رقت های سریال**** .

جدول 1 رقت شیب استاندارد

* سه تکرار کنید چاه ها هستند مورد نیاز است برای هر کدام تمرکز تشخیص محدوده است 5×10E1 کپی/μL~5×10E6 کپی/μL و این محدوده می تواند باشد در صورت نیاز گسترش می یابد.

** به کاهش دهد را شماره از تکرار کنید انجماد - ذوب و اجتناب کنید آلودگی، آن است توصیه می شود به فروشگاه را DNA کنترل کنید در کسری در -25~-15℃ برای را اول زمان

*** یک بار ذوب شده، DNA رقیق شدن بافر توانست باشد ذخیره شده است در 2-8 درجه سانتی گراد برای 7 روز، اگر نه استفاده می شود برای الف طولانی زمان، لطفا فروشگاه در -25~-15℃ .

**** بسازید مطمئن را قالب است به طور کامل مخلوط، به آرامی تکان دادن را مخلوط برای 15 ثانیه به 1 دقیقه برای هر کدام گرادیان رقیق شدن

2. بازیابی استخراج کنترل کنید (ERC) آماده سازی

غلظت DNA RCL را در ERC در صورت نیاز تنظیم کنید (نمونه ERC با 5×10E4 تهیه شد DNA RCL را به عنوان کپی می کند مثال) به شرح زیر:

1) 100 اضافه کنید نمونه آزمایش میکرولیتر در یک لوله تمیز 1.5 میلی لیتری، سپس 10 را اضافه کنید μL 5×10E3 کپی/μL استاندارد DNA RCL (Std4) و خوب مخلوط کنید، با علامت ERC مشخص شده است.

2) استخراج DNA از نمونه ERC را همراه با نمونه های آزمایشی انجام دهید تا نمونه ERC خالص شده آماده شود.

3. کنترل منفی راه حل (NCS) آماده سازی

کنترل منفی را در آزمایش تنظیم کنید، مراحل عملیات خاص به شرح زیر است:

1) 100 اضافه کنید ماتریس نمونه میکرولیتری (یا بافر رقت DNA) در یک لوله تمیز 1.5 میلی لیتری، سپس با علامت گذاری به عنوان NCS.

2) استخراج DNA NCS را انجام دهید نمونه همراه با نمونه های آزمایشی برای تهیه NCS خالص شده نمونه

4. بدون الگو کنترل کنید (NTC) آماده سازی

کنترل بدون الگو را در آزمایش تنظیم کنید، مراحل عملیات خاص به شرح زیر است:

1) NTC نیازی به پیش تیمار نمونه ندارد و می توان آن را در مرحله تشخیص qPCR DNA باقیمانده پیکربندی کرد. محتوا

2) نمونه NTC در هر لوله یا چاه 20 است میکرولیتر مخلوط (یعنی 15 μL RCL qPCR Mix + 4 μL RCL پرایمر و پروب مخلوط + 1 میکرولیتر IC) + 10 بافر رقت DNA μL. توصیه می شود که سه چاه تکراری را پیکربندی کنید.

5. PCR واکنش سیستم

سیستم واکنش جدول 2

* محاسبه کنید را کل PCR واکنش حجم توسط را شماره از واکنش ها: qPCR مخلوط کنید =( شماره از واکنش ها + 2) × (15+4+1) μL (از جمله را تلفات از دو چاه واکنش). بیش از سه تکرار برای هر نمونه در آزمایش توصیه می شود.

** بعد از دربندی را لوله یا آب بندی را صفحه، سانتریفیوژ را واکنش لوله یا بشقاب در پایین سرعت برای 10 ثانیه بعد از کافی تکان دادن و مخلوط کردن برای 5 ثانیه، تکرار کنید سانتریفیوژ به جمع آوری کنید را مایع از را درب یا دیوار به را پایین اجتناب کنید حباب ها در طول عملیات

برای تنظیم صفحه توصیه شده به جدول زیر مراجعه کنید:

جدول 3 کامپیوتر روشن مرجع هیئت مدیره

طرح صفحه شامل: 6 Std (منحنی استاندارد 6 غلظت استاندارد)، 1 NTC (بدون کنترل الگو)، 1 NCS (محلول کنترل منفی)، 3 TS (نمونه آزمایش)، 3 ERC (کنترل بازیابی استخراج).سه چاه تکراری برای هر نمونه

6. دستورالعمل های راه اندازی برای الف PCR ابزار

دستورالعمل های زیر فقط برای ترمو ابزار qPCR ABI 7500 (نرم افزار نسخه 2.0). اگر شما از a استفاده می کنید ابزارهای مختلف، برای دستورالعمل های راه اندازی به راهنمای ابزار قابل اجرا مراجعه کنید.

1) یک آزمایش جدید ایجاد کنید، الگوی کمیت مطلق را انتخاب کنید یا تعریف شده توسط کاربر

2) 1 کاوشگر تشخیص به نام "RCL-DNA" ایجاد کنید، فلوروفور گزارشگر را به عنوان "FAM" انتخاب کنید و فلوروفور را خاموش کنید. "هیچ"؛ 1 پروب تشخیص دیگر ایجاد کنید، "IC" را نامگذاری کنید و فلوروفور گزارشگر را به عنوان "CY5" انتخاب کنید و خاموش کنید فلوروفور به عنوان "هیچ" فلورسانس مرجع ROX است" (فلورسانس مرجع را می توان بر اساس مدل ساز و غیره را انتخاب کنید آیا شما باید آن را اضافه کنید).

3) در پنجره "نمونه ها"، تمام اطلاعات نمونه ها را به نوبه خود اضافه کنید. سپس چاه ها را انتخاب کنید، هدف را انتخاب کنید و نمونه ها به ترتیب تنظیم کنید وظیفه استاندارد DNA RCL را به عنوان استاندارد، و اختصاص دهید مقادیر 5000000، 500000، 50000، 5000، 500، 50 (واحد غلظت DNA در هر چاهک کپی بر میکرولیتر است) در ستون Quantity و نام ببرید.  چاه های Std 1, Std 2, Std 3, Std 4, Std 5, Std 6 به ترتیب. را تنظیم کنید وظیفه NTC به عنوان NTC. NCS، TS و ERC را به عنوان تنظیم کنید ناشناخته، و آنها را مطابق با طرح صفحه بالا نامگذاری کرد. سپس روی next کلیک کنید.

4) برنامه تقویت را تنظیم کنید: حجم واکنش را 30 میکرولیتر تنظیم کنید.

جدول 4 روش تقویت

7. تجزیه و تحلیل از qPCR نتایج

1) سیستم به طور خودکار آستانه در را می دهد پانل پلات تقویتی از تجزیه و تحلیل. آستانه داده شده توسط سیستم گاهی اوقات بیش از حد به خط مبنا نزدیک است و در نتیجه تفاوت زیادی ایجاد می کند در Ct بین چاهک های تکراری. می توانید به صورت دستی تنظیم کنید آستانه را در یک موقعیت مناسب قرار دهید و کلیک کنید تحلیل کنید. سپس می توانید در ابتدا بررسی کنید آیا منحنی تقویت در نمودار چند جزیی نرمال است یا خیر.

2) در نتیجه برگه تجزیه و تحلیل، نمودار منحنی استاندارد را مرور کنید. تایید کنید مقادیر برای R2، کارایی، شیب و رهگیری Y. برای یک منحنی استاندارد معمولی، R²> 0.99، 90%≤Eff%≤110%، -3.6≤شیب≤-3.1.

3) در مشاهده میز چاه در در تجزیه و تحلیل، غلظت هر نمونه به صورت کمی نشان داده شده است، واحد کپی/μL است، واحدها را می توان در گزارش سنجش تبدیل کرد.

4) تنظیمات پارامتر تجزیه و تحلیل نتایج باید بر اساس مدل خاص و نرم افزار باشد نسخه استفاده می شود، و به طور کلی می تواند به طور خودکار توسط ابزار تفسیر شود.

5) نرخ بازیابی سنبله را بر اساس نتایج آزمایش محاسبه کنید نمونه TS اندازه گیری می شود و سنبله نمونه بازیابی ERC، نرخ بازیابی سنبله مورد نیاز است بین 50٪ تا 150٪ باشد. فرمول سنج نرخ بازیابی مشخص شده:

بازیابی (%) = {Sample spiked assay (eg.copies/μL) - Sample assay (eg.copies/μL)} x حجم شستشو (μL) / نظری مقدار مقدار اضافه DNA (مثلاً کپی) x 100%

6) Ct ارزش از NCS کنترل منفی باید بزرگتر از میانگین باشد کمترین غلظت Ct از را استاندارد

7) کنترل رایگان الگو NTC باید Undetermined یا Ct باشد مقدار ≥38.

یادداشت ها

1. این محصول فقط برای استفاده تحقیقاتی است.
2. لطفا برای ایمنی خود با کت های آزمایشگاهی و دستکش های یکبار مصرف کار کنید.

3. لطفاً قبل از استفاده، این دفترچه راهنما را به دقت بخوانید این معرف، و آزمایش باید استاندارد شود، از جمله جابجایی نمونه، آماده سازی سیستم واکنش و نمونه اضافه شده

4. اطمینان حاصل کنید که هر جزء قبل از استفاده به طور کامل ورتکس شده و با سرعت کم سانتریفیوژ شده است.

دستی