پورومایسین یک آنتی بیوتیک آمینوگلیکوزید است که از تخمیر و متابولیسم Streptomyces alboniger تولید می شود و با مهار سنتز پروتئین، باکتری های گرم مثبت، سلول های مختلف حیوانات و حشرات را از بین می برد. پورومایسین در برخی موارد در برابر باکتری E. coli موثر است. مکانیسم این است پورومایسین یک آنالوگ از پایانه 3' مولکول های آمینویل-TrNA است که می تواند به محل A ریبوزوم متصل شود و در زنجیره پپتیدی گسترده گنجانده شود. پس از اتصال پورومایسین به محل A، در هیچ واکنش بعدی شرکت نخواهد کرد و در نتیجه سنتز پروتئین زودرس پایان می یابد و پلی پپتیدهای نابالغ حاوی پورومایسین در C-پایانه آزاد می شود.

ژن pac موجود در باکتری‌های تولیدکننده پورومایسین استرپتومایسس آلبونیگر، پورومایسین N-استیل ترانسفراز (PAC) را کد می‌کند که می‌تواند به پورومایسین مقاومت بدهد. این ویژگی در حال حاضر معمولاً برای غربالگری سویه‌های سلولی خاص پستانداران ترانسفکت شده با پلاسمیدهای حامل ژن pac اعمال می‌شود.

استفاده عمومی از پورومایسین در غربالگری سویه پایدار سلولی مربوط به خواص ناقل های لنتی ویروسی است و اکثر ناقل های تجاری لنتی ویروسی اکنون حامل ژن های pac هستند. در برخی موارد خاص، پورومایسین همچنین می تواند برای غربالگری سویه های E. coli تبدیل شده حامل پلاسمید ژن pac استفاده شود.

این محصول یک محلول استریل پورومایسین هیدروکلراید محلول در آب مقطر با غلظت 10 میلی گرم در میلی لیتر (10 میلی گرم در میلی لیتر در H) است.₂O)، می تواند مستقیماً با محیط کشت یا محلول بافر دیگری، مناسب برای کشت سلولی، غلظت کاری معمول 1-10 میکروگرم در میلی لیتر رقیق شود.

علاوه بر این، شرکت Yeasen همچنین پورومایسین هیدروکلراید (cat# 60210ES) را به صورت پودر ارائه می کند که در حالت متفاوت است اما عملکرد مشابهی دارد.

ویژگی ها

خلوص≥98%

استریل

برنامه های کاربردی

مناسب برای کشت سلولی

اسسویه های سلولی ترانسفکت شده پایدار پستانداران خاص creen حامل پلاسمیدهای حامل ژن pac

صفحه نمایش را سویه های E. coli تبدیل شده حامل پلاسمید ژن pac

مشخصات

اجزاء

حمل و نقل و ذخیره سازی

این صاورومایسین (10 میلی گرم در میلی لیتر در محلول) محصولات باید در دمای -15 درجه سانتیگراد نگهداری شوند ~ -25 درجه سانتیگراد برای 1 سال

دستورالعمل ها

1. تمرکز کاری پیشنهادی

سلول های پستانداران: 1-10 μگرم در میلی لیتر، غلظت بهینه باید با منحنی کشتن تعیین شود.

اشریشیا کلی: از محیط کشت LB آگار برای غربالگری اشریشیا کلی با ژن pac در غلظت 125 استفاده شد. μگرم در میلی لیتر

توجه داشته باشید: غربالگری سویه های E. coli پایدار با استفاده از پورومایسین نیاز به تنظیم دقیق pH دارد.

غلظت های توصیه شده از پورومایسین هیدروکلراید

2. تعیین پورومایسین منحنی کشتن (به عنوان مثال، ترانسفکشن shRNA یا انتقال لنتی ویروس)

غلظت غربالگری موثر از پورومایسین به نوع سلول، وضعیت رشد، تراکم سلولی، متابولیسم سلولی و موقعیت چرخه سلولی مربوط می شود.برای غربالگری برای بیان پایدار خطوط سلولی shRNA، تعیین حداقل غلظت پورومایسین که سلول های ترانسفکت نشده/ترانسدود شده را می کشد، بسیار مهم است. توصیه می شود مشتریانی که برای اولین بار آزمایش می کنند باید یک منحنی کشتن مناسب برای سیستم آزمایشی خود ایجاد کنند.

1) روز 1: صفحه 24 چاهی با چگالی 5 آبکاری می شود-8×104 سلول در چاه، و تعداد کافی چاهک برای آزمایش های گرادیان بعدی آبکاری می شود. سلول ها یک شبه در 37 انکوبه شدند℃.

2) روز 2: الف) محیط غربالگری را تهیه کنید: محیط تازه حاوی غلظت های مختلف پورومایسین (مانند 0-15). μگرم در میلی لیتر، حداقل 5 گرادیان)؛ ب) پس از انکوباسیون یک شبه، محیط غربالگری تازه تهیه شده را در سلول ها جایگزین کنید. سپس سلول ها در دمای 37 انکوبه می شوند℃.

3) روز 4: با محیط انتخابی تازه جایگزین کنید و زنده ماندن سلول را مشاهده کنید.

4) بسته به وضعیت رشد سلول ها، هر 2-3 روز یکبار به محیط انتخاب تازه تغییر دهید.

5) سلول ها روزانه برای مشاهده میزان سلول های زنده برای تعیین کمترین غلظت دارویی موثر برای از بین بردن سلول های غیر ترانسفکت شده یا تمام سلول های ترانسفکت نشده در 6-4 روز از شروع غربالگری آنتی بیوتیکی نظارت می شدند.

3. غربالگری خطوط سلولی ترانسفکت شده پایدار پستانداران

پس از ترانسفکشن پلاسمید حاوی ژن pac، سلول ها در محیطی حاوی پورومایسین تکثیر شدند تا ترانسفکتنت های پایدار انتخاب شوند.

1) 48 ساعت پس از ترانسفکشن، سلول ها (اصل یا رقیق شده) در محیط تازه حاوی غلظت مناسب پورومایسین کشت داده می شوند.

توجه داشته باشید:آنتی بیوتیک ها زمانی موثرتر هستند که سلول ها به طور فعال تقسیم شوند. اگر سلول ها بیش از حد متراکم باشند، اثربخشی آنتی بیوتیک ها به میزان قابل توجهی کاهش می یابد. بهتر است سلول‌ها را با تراکم بیش از 25 درصد صفحاتی کنید.

2) محیط کشت حاوی را بردارید و جایگزین کنید پورومایسین هر 2-3 روز

3) کانون های سلولی 7 روز پس از غربالگری ارزیابی می شوند. بسته به رده سلولی میزبان و کارایی غربالگری ترانسفکشن، ضایعات ممکن است به یک هفته یا بیشتر نیاز داشته باشند.

توجه: وضعیت رشد سلولی را هر روز رعایت کنید. غربالگری پورومایسین حداقل به 48 ساعت نیاز دارد و دوره غربالگری غلظت موثر پورومایسین عموماً 10-3 روز است.

4) 10-5 کلون مقاوم را در پتری دیش 35 میلی متری انتقال داده و قرار دهید و به مدت 7 روز با محیط انتخابی به کشت ادامه دهید. این فرهنگ غنی سازی برای آماده سازی برای آزمایش سمیت سلولی در آینده است.

اسناد:

برگه اطلاعات ایمنی

60209_MSDS_HB220420_EN.pdf

دفترچه راهنما

60209_دستی_HB250114_EN.pdf

استنادها و مراجع:

[1] Furge KA. et al., 2001. سرکوب تومورزایی و متاستاز با واسطه Ras از طریق مهار گیرنده Met تیروزین کیناز. PNAS 98:10722-7.

[2] Díaz J. و همکاران، 2014. Rab5 در سلول‌های سرطانی متاستاتیک برای فعال‌سازی، مهاجرت و تهاجم Rac1 با Caveolin-1 مورد نیاز است. J Cell Sci. 127:2401-6.

[3] Rössger K. و همکاران، 2013. کنترل فشار خون بر اساس پاداش توسط یک رابط مصنوعی مغز دوپامین. PNAS، 110:18150-5.

[4] Kamer I. و همکاران، 2005. Proapoptotic BID یک عامل ATM در سلول پاسخ به آسیب DNA است. 122:593-603.

[5] Charnaux N. و همکاران، 2005. RANTES (CCL5) باعث ریزش سریع وابسته به CCR5 از syndecan-1 (CD138) و syndecan-4 از سلول ها و اشکال HeLa می شود.

[6] Gao J، Zhao N، Knutson MD، و همکاران. پروتئین هموکروماتوز ارثی، HFE، جذب آهن را از طریق تنظیم پایین Zip14 در سلول‌های HepG2 [J] مهار می‌کند. مجله شیمی زیستی، 1387، 283(31):21462-8.

[7] هوانگ جی، دیبل سی سی، ماتسوزاکی ام، و همکاران. کمپلکس TSC1-TSC2 برای فعال سازی مناسب mTOR2[J] مورد نیاز است. زیست شناسی مولکولی و سلولی، 2008، 28 (12): 4104-4115.

[8] ناصر MW، Datta J، Nuovo G، و همکاران. ناصر MW، Datta J، Nuovo G، Kutay H، Motiwala T، Majumder S، Wang B، Suster S، Jacob ST، Ghoshal KDown تنظیم میکرو RNA-1 (miR-1) در سرطان ریه. سرکوب خاصیت تومورزایی سلول های سرطان ریه و حساس شدن آنها به آپوپتوز ناشی از دوکسوروبیسین توسط miR-1. J Biol Chem 283: 33394-33405 [J]. مجله شیمی زیستی، 1387، 283(48):33394-33405.

[9] Paatero AO، Hilkka T، Happonen LJ، و همکاران. ادغام باکتریوفاژ Mu در ژنوم مخمر و پستانداران [J]. تحقیقات اسیدهای نوکلئیک، 2008، 36(22): e148-e148.

[10] ژانگ دی و همکاران. یک مسیر غیر متعارف cGAS-STING-PERK برنامه ترجمه ای حیاتی برای پیری و فیبروز اندام را تسهیل می کند. Nat Cell Biol. مه 2022؛ 24 (5): 766-782. doi: 10.1038/s41556-022-00894-z. Epub 2022 2 مه. PMID: 35501370.

[11] لو تی، و همکاران. CD73 در وزیکول های خارج سلولی کوچک مشتق شده از HNSCC، سرکوب ایمنی مرتبط با تومور را با واسطه ماکروفاژها در ریزمحیط تعریف می کند. J Extracell Vesicles. مه 2022؛ 11 (5): e12218. doi: 10.1002/jev2.12218. PMID: 35524455; PMCID: PMC9077142.

[12] چن اس، و همکاران. شناسایی پروتئاز اختصاصی یوبیکوئیتین 32 به عنوان یک انکوژن در گلیوبلاستوما و مکانیسم های زمینه ای Sci Rep. 2022 آوریل 19; 12 (1): 6445. doi: 10.1038/s41598-022-09497-y. PMID: 35440702; PMCID: PMC9018837.

[13] هان ال، و همکاران. پروتئین 1 مرتبط با گلوبولین رحم (UGRP1) به پودوپلانین (PDPN) متصل می شود تا مسیر التهابی جدیدی را در طول عفونت استرپتوکوک پنومونیه ایجاد کند. Clin Transl Med. 2022 ژوئن؛ 12 (6): e850. doi: 10.1002/ctm2.850.PMID: 35652821; PMCID: PMC9161880.

[14] سان کیو و همکاران. محور MORTALIN-Ca2+ مقاومت ذاتی ریتوکسیماب را در لنفوم سلول B منتشر بزرگ ایجاد می کند. سرطان لت. 1 ژوئیه 2022; 537:215678. doi: 10.1016/j.canlet.2022.215678. Epub 2022 Apr 18. PMID: 35447282.