سولفات G418 که با نام ژنتیکین سولفات نیز شناخته می شود، یک آنتی بیوتیک آمینو گلیکوزید است و از نظر ساختاری شبیه جنتامایسین B1 است. با اتصال ریبوزوم 80s و مسدود کردن مراحل افزایش طول، در سنتز پروتئین دخالت می کند. سولفات G418 برای سلول‌های پروکاریوتی و یوکاریوتی از جمله باکتری‌ها، مخمرها، سلول‌های گیاهی و پستانداران و همچنین تک یاخته‌ها و کرم‌ها سمی است. ژن مقاومت (عمدتا neo)، واقع در ترانسپوزون Tn601 (903) یا Tn5، از باکتری مشتق شده است، اما می تواند در سلول های یوکاریوتی بیان شود. ژن مقاومت را می‌توان از طریق تکنیک‌های نوترکیبی ژن وارد سلول‌ها کرد تا مقاومت G418 را به دست آورد، که می‌تواند برای غربالگری و حفظ کشت سلول‌های پروکاریوتی یا یوکاریوتی حامل ژن مقاومت استفاده شود.

در سلول های پستانداران، نئو، بیان آمینو گلیکوزید 3'-فسفوترانسفراز (APH (3') II) را پس از ادغام در ژنوم یوکاریوتی رمزگذاری می کند. این آنزیم با اصلاح کووالانسی عملکرد آمینو یا هیدروکسیل G418 و مهار برهمکنش آنتی بیوتیک-ریبوزوم، آنتی بیوتیک را غیرفعال می کند و مقاومت G418 را به سلول می بخشد. در غربالگری آزمایش‌های رده سلولی پایدار، منحنی‌های کشتن (منحنی‌های دوز-پاسخ) باید برای تعیین حداقل غلظت مؤثر برای کشتن سلول‌های غیرمقاوم ایجاد شوند.

در سلول های گیاهی، مقاومت را می توان با ترانسفکشن پلاسمید مقاوم به ژن nptII به دست آورد. ژن nptII همچنین آمینوگلیکوزید فسفوترانسفراز را کد می کند، آنزیمی که چندین آنتی بیوتیک از جمله G418، کانامایسین و پالومایسین را غیرفعال می کند.

ویژگی ها

خلوص≥98%

تولید استاندارد، با استفاده از حالت تولید انبوه کارخانه

طیف گسترده ای از کاربردها، که می تواند در زمینه های بیولوژی مولکولی و تحقیقات تجربی بیوشیمیایی کشت بافت مورد استفاده قرار گیرد.

پلت فرم همکاری کل را پوشش می دهد

برای اطمینان از ثبات کیفیت محصول، تفاوت بین دسته ها در 1٪ کنترل می شود.

برنامه های کاربردی

غربالگری رده های سلولی ترانسفکت شده پایدار

مشخصات

اجزاء

حمل و نقل و ذخیره سازی

این سولفات G418 (ژنتیکین) محصولات باید در دمای -15 درجه سانتیگراد نگهداری شوند ~ -25 درجه سانتیگراد برای 3 سال

دستورالعمل ها

1. تهیه محلول ذخیره سازی G418 (50 میلی گرم در میلی لیتر، غلظت فعال)

1) تبدیل واحدهای فعالیت

تبدیل طبق این فرمول انجام شد: (1000/A0) ×A1=A2

A0: مقدار توان G418 که از دسته ای به دسته دیگر متفاوت است. گزارش کیفیت دسته ای یا برچسب روی بطری را ببینید.

A1: غلظت G418 فعال مورد نظر شما.

A2: غلظت واقعی G418.

به عنوان مثال، اگر مقدار فعالیت G418 دسته 750 U/mg و غلظت فعال G418 50 mg/mL باشد، غلظت پودر واقعی برای تهیه 1000/750×50 mg/mL=66.67 mg/mL است. اگر 10 میلی لیتر محلول ذخیره سازی G418 (غلظت فعال، 50 میلی گرم بر میلی لیتر) تهیه شود، باید 7/666 میلی گرم پودر وزن شود.

2) عقیم سازی و نگهداری

پودر واقعی حاصل از تبدیل فوق را وزن کرده و 10 میلی لیتر آب استریل دیونیزه شده به آن اضافه کنید تا کاملا حل شود.

فیلتر سوزنی 0.22 میکرومتری را با 5 میلی لیتر آب دیونیزه استریل از قبل خیس کنید و سپس محلول G418 را با فیلتراسیون استریل کنید.محلول استریل شده G418 را جدا کنید و در دمای -20 درجه سانتیگراد نگهداری کنید.

توجه: ① محلول کدر را فیلتر نکنید، زیرا محلول به طور کامل حل نشده است، فرآیند فیلتراسیون باعث از بین رفتن دارو می شود، فعالیت محلول نهایی را کاهش می دهد. ② استفاده از محیط های کشت، محلول های فسفات یا حلال های آلی برای تهیه محلول ذخیره سازی توصیه نمی شود.

2. معمولاً از غلظت غربالگری استفاده می شود

به طور کلی، غلظت بالایی از G418 در ابتدا برای غربالگری ترانسفورترها و استفاده از غلظت کم برای حفظ فرهنگ مورد نیاز است. شرایط رشد، انواع سلول ها و سایر عوامل محیطی ممکن است بر دوز موثر G418 تأثیر بگذارد، بنابراین توصیه می شود غلظت غربالگری بهینه را از طریق منحنی کشتار (منحنی دوز-پاسخ) تعیین کنید.

به طور کلی، محدوده غربالگری سلول های پستانداران 200-2000 میکروگرم در میلی لیتر، سلول های گیاهی: 10-100 میکروگرم در میلی لیتر، سلول های مخمر: 500-1000 میکروگرم در میلی لیتر است.

داده های آزمایشی خط سلولی

3. ایجاد منحنی کشتار

توجه: به منظور غربالگری رده های سلولی با بیان پایدار پروتئین های هدف، تعیین حداقل غلظت آنتی بیوتیک هایی که می توانند سلول های میزبان ترانسفکت نشده را از بین ببرند ضروری است. این را می توان با ایجاد یک منحنی کشتار (منحنی دوز-پاسخ) به دست آورد. حداقل شش غلظت باید انتخاب شود. G418 هنگام درمان سلول میتوز بیشترین فعالیت را دارد، بنابراین سلول ها باید قبل از افزودن G418 برای مدتی کشت شوند.

1) روز 1: سلول های تبدیل نشده در یک صفحه کشت مناسب با تراکم سلولی 20-25٪ در دمای 37 درجه سانتیگراد قرار می گیرند و یک شبه در CO کشت می شوند.₂;

توجه: برای سلول هایی که برای تشخیص زنده ماندن نیاز به تراکم بالاتری دارند، می توان میزان تلقیح را افزایش داد.

2) گرادیان غلظت G418 را با توجه به نوع سلول در محدوده مناسب تنظیم کنید. سلول های پستانداران را می توان در 0، 50، 100، 200، 400، 800، 1000 میکروگرم بر میلی لیتر تنظیم کرد.

3) روز 2: محیط قدیمی را بردارید و آن را با یک محیط تازه آماده شده حاوی غلظت مربوط به دارو جایگزین کنید. برای هر غلظت سه موازی ایجاد کنید.

4) سپس هر 3 تا 4 روز یک بار با محیط تازه حاوی G418 جایگزین کنید.

5) شمارش سلول های زنده در یک سیکل ثابت (مثلاً هر 2 روز) برای تعیین غلظت مناسب انجام می شود. حداقل غلظت را انتخاب کنید، که اکثر سلول ها را در یک تعداد ایده آل روز (معمولا 10-7 روز) از بین می برد، به عنوان غلظت کاری برای غربالگری سلول های ترانسفکشن پایدار.

4. غربالگری سلول های ترانسفکت شده پایدار

1) 48 ساعت پس از ترانسفکشن، از محیط کشت G418 حاوی غلظت مناسب برای زیرکشت (زیرکشت مستقیم یا زیر کشت رقیق) استفاده شد.

توجه: برای به دست آوردن نتایج غربالگری خوب، توصیه می شود سلول ها را بیش از 25 درصد رقیق کنید.

2) محیط غربالگری حاوی دارو را هر 3 تا 4 روز تعویض کنید.

3) تشکیل کلونی سلولی را پس از 7 روز غربالگری اندازه گیری کنید. تشکیل کلنی ممکن است یک هفته دیگر یا بیشتر طول بکشد، بسته به نوع سلول میزبان، ترانسفکشن و اثربخشی غربالگری.

4) 10-5 کلون مقاوم انتخاب و به پلیت های کشت سلولی 35 میلی متری منتقل شدند و با محیط غربالگری حاوی دارو به مدت 7 روز کشت داده شدند.

5) با محیط معمولی جایگزین کنید.

اسناد:

برگه اطلاعات ایمنی

60220_MSDS_HB220421_EN.pdf

دفترچه راهنما

60220_دستی_HB250115_EN.pdf

ارقام

شکل 1.تست پایداری و تایید غلظت موثر ژنومایسین بین دسته های مختلف

سویه آزمایشی: E. coli

G69 و G99 دو دسته متفاوت هستند

غلظت مصرفی ژنومایسین به ترتیب 8 میلی گرم در لیتر، 12 میلی گرم در لیتر و 16 میلی گرم در لیتر و حداقل غلظت مؤثر 16 میلی گرم در لیتر تعیین شد که به طور کامل از رشد باکتری های متفرقه جلوگیری کرد. عملکرد دو دسته ثابت بود.