هیگرومایسین B، یک آنتی بیوتیک آمینوگلیکوزید سنتز شده توسط Streptomyces hygroscopicus، با تداخل در جابجایی ریبوزومی 70S و القای اشتباه خواندن الگوی mRNA، سنتز پروتئین را مهار می‌کند، بنابراین پروکاریوت‌ها (مانند باکتری)، یوکاریوت‌ها (مانند قارچ‌های قارچی قارچ‌های قارچی، eukaryots و قارچ‌های قارچی بالاتر را از بین می‌برد.

ژن های مقاومت به هیگرومایسین (hyg یا hph) مشتق شده از Escherichia coli هیگرومایسین B فسفوترانسفراز را رمزگذاری می کند که هیگرومایسین B را به یک محصول فسفریله غیر فعال بیولوژیکی سم زدایی می کند و آن را به یک نشانگر انتخابی عالی برای غربالگری و کشت موفقیت آمیز مقاومت ژنتیکی یا یوکاریوتی با سلول های ترانس عفونی شده با سلول های یوکاریوتی تبدیل می کند. علاوه بر این، به دلیل حالت‌های مختلف عمل، Hygromycin B اغلب در ترکیب با G418 یا Blasticidin S برای انتخاب رده‌های سلولی مقاوم به دو مورد استفاده می‌شود. Hygromycin B همچنین می تواند به عنوان یک عامل ضد ویروسی استفاده شود زیرا به طور انتخابی به سلول هایی با افزایش نفوذپذیری غشاء به دلیل عفونت ویروسی نفوذ می کند و از ترجمه جلوگیری می کند. همچنین می تواند به عنوان یک دفع کننده حشرات از طریق مخلوط با خوراک حیوانات عمل کند.

علاوه بر این، شرکت Yeasen نیز Hygromycin B (cat# 60224ES) به صورت محلول که حالت متفاوتی دارد اما عملکرد مشابهی دارد.

ویژگی ها

تولید استاندارد، با استفاده از حالت تولید انبوه کارخانه

برنامه های کاربردی

غربالگری رده های سلولی ترانسفکت شده پایدار

مشخصات

اجزاء

حمل و نقل و ذخیره سازی

این هیگرومایسین B محصولات باید در -15℃ ~ -25℃ برای 2 سال

دستورالعمل ها

1. تهیه محلول استوک (50 میلی گرم در میلی لیتر)

0.5 گرم هیگرومایسین B را وزن کرده و به 10 میلی لیتر از 1 اضافه کنید×PBS، pH 7.4. پس از انحلال کامل، از طریق 0.22 فیلتر کنید μm فیلتر برای استریل کردن. به حجم های کوچک برای یک بار مصرف (به عنوان مثال، 1 میلی لیتر) تقسیم کنید و در 25- تا 15- نگهداری کنید℃یا 2 به 8℃.

2. معمولاً از غلظت غربالگری استفاده می شود

غلظت کاری هیگرومایسین B که برای غربالگری سویه‌های انتقال پایدار استفاده می‌شود، بسته به نوع سلول، محیط، شرایط رشد و سرعت متابولیسم سلول، با غلظت‌های توصیه شده 50-1000 باید متفاوت باشد. μگرم در میلی لیتر برای اولین سیستم آزمایشی، یک منحنی کشتار (منحنی کشتن)، منحنی واکنش دوز، برای تعیین غلظت غربالگری بهینه توصیه می‌شود.

به طور کلی سلول های پستانداران: 50-500 μگرم در میلی لیتر؛ سلول های باکتریایی/گیاهی: 20-200 μگرم در میلی لیتر؛ قارچ: 300-1000 μگرم در میلی لیتر

3. ایجاد منحنی کشتار

توجه: به منظور غربالگری رده های سلولی پایدار، تعیین حداقل غلظت آنتی بیوتیک هایی که قادر به کشتن سلول های میزبان ترانسفکت نشده هستند ضروری است. این را می توان با ایجاد یک منحنی کشتار (منحنی دوز-پاسخ) به دست آورد. حداقل پنج غلظت باید مرتب شود.

1) روز 1: سلول های تبدیل نشده در یک صفحه کشت مناسب با تراکم سلولی 20-25 درصد قرار می گیرند و یک شبه کشت می شوند.

توجه: مقدار سلول های تلقیح را می توان برای سلول هایی که برای تشخیص حیات نیاز به تراکم بالاتری دارند افزایش داد.

2) با توجه به نوع سلول، گرادیان غلظت را در محدوده مناسب تنظیم کنید.سلول پستانداران می تواند 50، 100، 250، 500، 750، 1000 را تنظیم کند. μگرم در میلی لیتر محلول هیگرومایسین B را به نسبت 1:10 با آب دیونیزه یا بافر PBS تا 5 میلی گرم بر میلی لیتر رقیق کنید. و سپس طبق جدول زیر محلول را به غلظت کاری مربوطه رقیق کنید.

3) روز 2: با یک محیط تازه آماده شده حاوی غلظت متناظر دارو جایگزین کنید. برای هر غلظت سه نمونه موازی تهیه کنید.

4) سپس هر 3-4 روز یکبار با محیط های تازه حاوی دارو جایگزین کنید.

5) شمارش سلول های زنده را در فواصل زمانی ثابت (مانند هر 2 روز) انجام دهید تا غلظت مناسبی را که مانع از رشد سلول های ترانسفکت نشده می شود، تعیین کنید. کمترین غلظتی را که می‌تواند اکثریت سلول‌ها را در تعداد ایده‌آل روزهای (معمولاً 10-7 روز) از بین ببرد، به عنوان غلظت کاری برای انتخاب ترانسفکتنت پایدار انتخاب کنید.

4. غربالگری خطوط سلولی ترانسفکت شده پایدار پستانداران

1) 48 ساعت پس از ترانسفکشن، سلول ها با محیط غربالگری حاوی هیگرومایسین B در غلظت مناسب (مستقیم یا رقیق) زیر کشت شدند.

توجه: آنتی بیوتیک ها در تقسیم فعال سلول ها بهترین عملکرد را دارند. اگر سلول ها خیلی متراکم باشند، آنتی بیوتیک سلول ها را از بین نمی برد. سلول ها را به گونه ای تقسیم کنید که سلول ها بیش از 25٪ به هم متصل نباشند.

2) محیط غربالگری را هر 3-4 روز یکبار تغییر دهید.

3) تشکیل کلونی سلولی را پس از 7 روز غربالگری اندازه گیری کنید. تشکیل کلنی ممکن است یک هفته دیگر یا بیشتر طول بکشد، بسته به نوع سلول میزبان، ترانسفکشن و اثربخشی غربالگری.

4) 5 تا 10 کلون مقاوم را انتخاب کنید و به صفحات کشت سلولی 35 میلی متری منتقل کنید و با محیط غربالگری حاوی دارو به مدت 7 روز کشت کنید.

5) با محیط تازه بدون دارو برای کشت جایگزین کنید.

اسناد:

برگه اطلاعات ایمنی

60225_MSDS_HB220420_EN.pdf

دفترچه راهنما

60225_دستی_HB250115_EN.pdf