Penyakit diabetes melitus (DM), penyakit metabolik kronis sistemik yang ditandai dengan peningkatan glukosa darah kronis yang disebabkan oleh kombinasi beberapa faktor penyakit, merupakan epidemi kesehatan global dan terkait dengan genetika keluarga, faktor lingkungan, dan autoimunitas. Meskipun DM sudah dikenal selama ribuan tahun dan kemajuan besar telah dicapai dalam diagnosis dan penanganannya, saat ini belum ada obat untuk penyakit ini dan konsekuensinya terhadap kesehatan masyarakat terus bertambah. Oleh karena itu, sangat penting untuk membuat model hewan DM yang tepat dan menjelaskan patogenesis DM dan komplikasinya. Model hewan DM yang umum digunakan adalah reseksi bedah pankreas, diabetes yang diinduksi secara kimia, model hewan diabetes spontan, dan hewan transgenik, dll.
Saat ini, model penyakit diabetes yang disebabkan oleh Streptozotosin (STZ) digunakan secara luas, cocok untuk pengamatan jangka panjang. STZ adalah senyawa nitrosourea yang, setelah masuk ke dalam tubuh, dapat secara spesifik menghancurkan sel-β pankreas melalui mekanisme berikut:
(1) Penyuntikan STZ dosis tinggi dapat menyebabkan penurunan konsentrasi koenzim I intraseluler (NAD) pada sel-β, sehingga menghambat metabolisme energi dan protein yang bergantung pada NAD, sehingga mengakibatkan kematian sel;
(2) STZ meningkatkan oksida nitrat (NO) produksi, yang telah terbukti berpartisipasi dalam kerusakan sel β;
(3) Bila diberikan dalam dosis rendah, STZ dapat memicu proses autoimun yang menyebabkan kerusakan sel-β pulau pankreas: sel-β yang mati, akibat dosis rendah STZ, dapat difagositosis oleh makrofag sebagai antigen untuk menghasilkan faktor perangsang Th1, sehingga limfosit tipe Th1 menjadi dominan. Kemudian limfosit tipe Th1 menghasilkan IL-2 dan IFN-γ, yang menyebabkan infiltrasi sel inflamasi di pulau pankreas dan pelepasan IL-1 dan TNF-α, IFN-γ, NO dan H2HAI2 untuk membunuh sel, yang akhirnya menyebabkan DM.
1 SOP Standar Konstruksi Model Diabetes Induksi STZ
1.1 Persiapan hewan
Terdapat dimorfisme seksual yang nyata dan jantan lebih rentan terkena diabetes. Karena estrogen mengganggu aksi STZ, hewan betina kurang sensitif terhadap aksi diabetogenik STZ dibandingkan jantan. Penelitian telah menunjukkan bahwa betina memiliki tingkat pemodelan yang buruk dan tingkat kematian yang lebih tinggi daripada jantan, terutama tipe I.
Diabetes tipe I (T1DM):Tikus (170-200 g) dan tikus (17-22 g) direkomendasikan. Setelah satu minggu pemberian makanan adaptif, hewan harus dipuasakan selama 12 jam, diikuti dengan penyuntikan intraperitoneal STZ, yang dapat dilakukan dengan mudah dan dengan tingkat keberhasilan yang tinggi.
Diabetes tipe II (T2DM): Tikus (umur 4-5 minggu, berat 90-100 g, misalnya SD atau Wistar) dan mencit (umur 4-5 minggu, berat 16-20 g, misalnya C57, ICR atau Kunming) harus diberi makan makanan berlemak tinggi dan tinggi gula selama 4-6 minggu sebelum pemberian STZ, dan berat badan masing-masing dapat mencapai sekitar 240-280 g dan 30-35 g. SD direkomendasikan untuk tikus dan C57 untuk mencit.
1.2 Pemberian Pakan Ternak Sebelum Pemberian STZ
T1DM: Biarkan semua tikus bebas mengakses makanan hewan pengerat standar dan air selama 1-2 minggu pemberian makanan adaptif sebelum pengobatan STZ.
Diabetes tipe 2: Konsumsi makanan tinggi lemak dan tinggi gula untuk membuat insulin resisten sebelum pengobatan STZ.
1.3 Persiapan reagen
① Diet tinggi lemak dan gula
Diet tinggi lemak dan tinggi gula dibuat dengan mencampur pakan dasar tikus dengan sukrosa, lemak babi olahan, dan bubuk kuning telur dalam perbandingan massa: proporsinya adalah 10% lemak babi, 20% sukrosa, 10% bubuk kuning telur, 0,5% natrium kolat, dan 59,5% pakan dasar.
② Penyangga STZ-natrium sitrat
Penyiapan Larutan A dan Larutan B: Timbang 2,1 g asam sitrat (BM: 210,14) dan larutkan dalam 100 mL air suling ganda untuk membuat Larutan A; timbang 2,94 g natrium sitrat (BM: 294,10) dan larutkan dalam 100 mL air suling ganda untuk membuat Larutan B.
Persiapan Penyangga Natrium Sitrat: Campurkan larutan A dan B dalam rasio tertentu (1:1,32 atau 1:1), sesuaikan pH menjadi 4,2-4,5, dan sterilkan dengan filter menggunakan membran filter 0,22 μm. Ini menghasilkan penyangga natrium sitrat yang dibutuhkan; disarankan untuk segera menyiapkan dan menggunakannya.
Timbang bubuk STZ yang telah dikeringkan, masukkan ke dalam botol kering dan steril, bungkus dengan aluminium foil, dan taruh di atas es. Tambahkan buffer natrium sitrat yang telah didinginkan sebelumnya (1% b/v) hingga larut, lalu saring dan sterilkan menggunakan membran penyaring 0,22 μm.
【Catatan】① Setelah bubuk STZ dikeluarkan dari lemari es, bubuk tersebut harus disimpan pada suhu ruangan dan terhindar dari cahaya selama sekitar 10 menit hingga benar-benar mencair. ② Setelah ditimbang, botol yang berisi sampel STZ harus ditutup dengan aluminium foil untuk melindunginya dari cahaya, karena STZ tidak stabil. ③ Jangan melarutkan STZ sekaligus jika Anda tidak ahli dalam penyuntikan. Sebaiknya STZ dilarutkan dalam kelompok sesuai dengan kemampuan pengoperasian. Siapkan larutan STZ untuk satu kelompok sekaligus, misalnya 10 atau 15 ekor tikus per kelompok.
1.4 Injeksi STZ
Berikan suntikan secara intraperitoneal atau melalui vena ekor berdasarkan berat puasa hewan. Dibandingkan dengan suntikan intraperitoneal, suntikan vena ekor memiliki efisiensi penggunaan obat yang lebih tinggi tetapi secara teknis lebih menantang. Jika teknik penyuntikan tidak mahir, lakukan penyuntikan secara bergantian di antara dua kelompok, dan penyuntikan harus selesai dalam waktu 30 menit.
T1DM: Untuk tikus, dosis tinggi tunggal dianjurkan sebesar 100-200 mg/kg, dan beberapa dosis rendah sebesar 20-50 mg/kg selama lima hari berturut-turut; untuk tikus, dosis disarankan sebesar 40-70 mg/kg, diberikan dalam satu suntikan.
Diabetes tipe 2:Setelah diberi makanan tinggi gula dan tinggi lemak selama 1-2 bulan, untuk tikus, dosis yang dianjurkan adalah 70-120 mg/kg, diberikan dalam satu suntikan; untuk tikus, dosis yang disarankan adalah 25-40 mg/kg, diberikan dalam satu suntikan.
【Catatan】Disarankan untuk melakukan pra-eksperimen guna menentukan dosis STZ yang tepat, mengingat perbedaan berat badan, toleransi obat, waktu puasa, metode penyuntikan, dan proses pemberian makan pada hewan percobaan. Jangan melakukan eksperimen secara membabi buta sesuai dengan dosis yang tertera dalam literatur.
1.5 Pasca injeksi
Setelah penyuntikan STZ, biarkan hewan bebas minum dan makan. Ganti bantalan setiap hari. Jaga kandang tetap bersih dan kering. Hindari sinar matahari yang terik. Lakukan disinfeksi sesering mungkin.
【Catatan】Setelah penyuntikan STZ, kadar glukosa darah hewan akan menunjukkan tiga fase: hiperglikemia sementara (1-2 jam), hipoglikemia sementara (6-10 jam), dan hiperglikemia berkelanjutan (>72 jam). Insulin dan glukosa harus diberikan dengan benar.
1.6 Obat Pemodelan Hewan
Untuk model yang tidak memenuhi kriteria, STZ dapat diberikan tambahan setelah hewan stabil (dengan suntikan intraperitoneal pada dosis 10-20 mg/kg, memilih dosis yang tepat berdasarkan situasi sebenarnya), atau menunggu hingga kadar glukosa darah kembali normal dan kemudian menyuntikkan pada dosis rutin. Namun, untuk mencapai efek yang diinginkan, sering kali perlu memulai kembali proses pemodelan setelah kembali ke keadaan normal.
2 Evaluasi DM yang disebabkan oleh STZ model hewan
① Ciri-ciri umum: kehilangan berat badan, polidipsia, polifagia, dan poliuria.
② Glukosa darah puasa (FGB), kadar insulin serum (FINS), toleransi glukosa oral (OGT), insulin serum puasa (FSI) dan sensitivitas insulin.
③ Indeks biokimia serum: T-Cho, TG, HDL-C, LDL-C, CR, BUN, Alt, dll.
Nomor ④ Patologi pankreas: Pewarnaan H&E.
3 Kemungkinan alasan kegagalan model DM yang diinduksi STZ
① Kualitas STZ buruk. Kemurnian STZ untuk pemodelan tidak boleh kurang dari 98% (deteksi HPLC).
② Degradasi STZ. STZ merupakan larutan yang mudah lembap, harus dijaga tetap kering, untuk menghindari kelembapan. Bubuk ini tidak dapat disimpan dalam suhu ruangan untuk waktu yang lama, dan STZ yang terlarut sangat tidak stabil, dengan waktu paruh pH netral 15 menit, dan harus digunakan sebagai pengganti. Larutkan STZ dengan nilai pH asam, sebaiknya dalam penangas es.
③ Larutan STZ disuntikkan ke usus atau organ lain.
Jika model gagal memenuhi standar DM, disarankan untuk mengamati selama 3 hari lagi. Jika masih gagal, ulangi prosedur injeksi.
4 Penyebab tingginya kematian hewan yang diinduksi oleh STZ
① Hewan kekurangan berat badan.
② Pasokan air minum tidak mencukupi.
③ Hiperglikemia atau hipoglikemia, biasanya hiperglikemia. Kondisi ini dapat diatasi dengan suntikan insulin atau suplemen glukosa sementara.
Metode suplemen insulin: misalnya, jika Novolin N atau NPH (insulin seng protamin netral) diberikan 2-3 unit setiap kali, kematian umum tikus akan lebih rendah setelah 3-5 hari.
Metode suplementasi glukosa: Injeksi intraperitoneal glukosa 20% 4 jam setelah injeksi STZ dapat menghindari kematian tikus akibat glukosa darah rendah yang disebabkan oleh puasa.
Nomor ④ Hewan percobaan saling membunuh karena kekurangan pasokan makanan dan air.
⑤ Infeksi. Hewan penderita DM lebih rentan terhadap infeksi daripada hewan lainnya, terutama infeksi saluran kemih dan infeksi perut, karena poliuria. Disinfeksi perlu dilakukan sebelum dan sesudah tindakan invasif seperti injeksi intraperitoneal, injeksi subkutan, dan pengambilan darah. Misalnya, tetrasiklin (atau salep mata aureomisin) dapat dioleskan ke luka setelah pengukuran glukosa darah setiap kali untuk mencegah infeksi.
5 Faktor yang Mempengaruhi Pemodelan Diabetes
Faktor-faktor yang memengaruhi model penyakit diabetes meliputi kualitas reagen pemodelan STZ, kondisi hewan, dan metode pemberian. Karakteristik kinerja utama reagen meliputi kemurnian, stabilitas, dan kelarutan. Kondisi hewan terutama meliputi latar belakang genetik, jenis kelamin, berat badan, lingkungan pengembangbiakan, dan struktur makanan. Metode pemberian meliputi waktu pemberian, interval antara dosis, dan rute pemberian. Faktor-faktor yang dibedakan menghasilkan efek pemodelan yang dibedakan.
6 Produk Rrekomendasi
| Nama Produk | Kucing# | Spesifikasi |
| 60256ES60 | 100mg talas | |
| 60256ES76 | 500mg talas | |
| 60256ES80 | 1 gram | |
| Asam Sitrat, Monohidrat | 60347ES25 | 25 gram |
| Garam Trinatrium Asam Sitrat, Dihidrat | 60348ES25 | 25 gram |
| Pelarut Untuk Streptozocin STZ | Nomor telepon 60750ES76 | 500 ml air |
[1] Xi Z, dkk. Nanopartikel yang dimodifikasi ganda mengatasi hambatan penyerapan berurutan untuk pengiriman insulin oral. J Control Release. Februari 2022;342:1-13. (PMID: 34864116, JIKA: 7.727)