Teman-teman sekalian, apakah Anda merasa bingung ketika menghadapi berbagai Antibodi Loading Control dan Epitope Tagging selama imunoblotting protein? Loading Control Protein dikodekan oleh gen-gen housekeeping dalam organisme dan diekspresikan secara stabil dalam beberapa jaringan. Protein digunakan untuk memverifikasi apakah eksperimen imunologi berjalan normal dan sebagai standar deteksi semi-kuantitatif untuk ekspresi protein. Jadi, bagaimana cara memilih antibodi kontrol pemuatan dengan benar? Anda dapat merujuk pada poin-poin berikut.
I. Contoh Asal Spesies
- Untuk sampel dari jaringan atau sel mamalia, umumnya memilih β-aktin, α-tubulin, GAPDH, Lamin-B, Histone H3, Na+/K+-ATPase.
- Untuk sampel yang berasal dari tumbuhan, umumnya memilih aktin tumbuhan, Rubisco, dll.
- Untuk sampel lain dengan penelitian lebih sedikit, pilih protein yang sesuai sebagai referensi internal dengan berkonsultasi pada literatur atau basis data yang relevan.
Pastikan berat molekul protein target berbeda dari kontrol pemuatan lebih dari 5KDa untuk mencegah gangguan selama deteksi. Misalnya, jika protein target adalah 40KDa, tidak cocok untuk memilih β-aktin (42KDa) sebagai kontrol pemuatan. Pertimbangkan untuk menggunakan GAPDH (36KDa) atau β-tubulin (55KDa) sebagai kontrol pemuatan.
III. Situs Ekspresi Protein Referensi Internal
Catatan: Hindari situasi berikut saat menggunakan antibodi kontrol pemuatan
| Lokalisasi Subseluler | Memuat Protein Kontrol | Berat Molekul (KDa) | Catatan |
| Sitoplasma, Sel Utuh | β-aktin | 42 | Tidak cocok untuk ekstrak nuklir. β-aktin merupakan komponen kompleks perombakan kromatin; mungkin tidak cocok untuk situasi yang memiliki perbedaan usia signifikan di antara subjek penelitian. |
| α-Tubulin | 55 | Tidak cocok untuk situasi di mana terdapat perbedaan usia yang signifikan di antara subjek penelitian. Ekspresi tubulin berubah dengan obat antimikroba dan antimitotik, sehingga tidak cocok saat menambahkan obat antikanker dan antijamur. | |
| β-Tubulin | 55 | ||
| GAPDH | 36 | Hipoksia sel akan menyebabkan ekspresi GAPDH meningkat, sehingga tidak cocok untuk penelitian yang berhubungan dengan oksigen. Faktor-faktor seperti diabetes dapat menyebabkan peningkatan ekspresi GAPDH. | |
| Vinculin | 117 | Dapat dirujuk untuk protein dengan berat molekul besar. | |
| Mitokondria | Seri COXIV | 15-17 | Rangkaian protein ini sebagian besar terkonsentrasi pada 15-17KDa. Jika berat molekul protein target mendekati, pertimbangkan antibodi kontrol pemuatan lainnya. |
| HSP60 | 60 |
| |
| Inti | VDAC1/2 | 31-37 | Rangkaian protein ini terutama terkonsentrasi pada 31-37KDa. |
| Laminasi B1 | 66 | Tidak cocok untuk sel induk embrionik, tidak cocok sebagai kontrol pemuatan dalam percobaan apoptosis. | |
| Bahasa Indonesia: PCNA | 36 | Tidak cocok untuk sel yang tidak berproliferasi. | |
| TBP | 33-43 | TBP adalah 37-43KDa pada manusia dan 33-36KDa pada tikus dan mencit, tidak cocok untuk percobaan apoptosis. | |
| Tahun 1 | 65-70 |
| |
| Histon H3 | 17 | Sebagian besar protein memiliki berat molekul sekitar 17KDa. Jika berat molekul protein target mendekati, pertimbangkan antibodi kontrol beban panjang lainnya. | |
| Darah Utuh, Serum, Plasma | Transferin | 77 | Ekspresi dipengaruhi oleh kondisi penyakit dan pengobatan tertentu, seperti asam retinoat. |
| Albumin | 66 | Kontennya sangat tinggi, perhatikan pengurangan pemuatan sampel dalam eksperimen WB. |
Label Antibodi Bekerja Lebih Baik Bila Digunakan Bersama-sama
Dalam percobaan yang mempelajari interaksi protein, seperti pull-down, tag epitop dapat digabungkan ke terminal N atau C dari protein target melalui metode biologi molekuler. Tag epitop yang umum digunakan meliputi His, HA, Myc, dan GST. Tag epitop ini biasanya tidak memengaruhi aktivitas biologis dan lokalisasi intraseluler dari protein target. Munculnya tag epitop telah memberikan kemudahan bagi penelitian ilmiah dan produksi industri.
| Tag Epitop | Urutan Tag | Berat Molekul (KDa) |
| Tag HA | YPYDVPDYA | 1.1 |
| Tag Myc | EQKLISEEDL | 1.2 |
| Tag Bendera | DYKDDDDK | 1 |
| Tag PPN | - | 26 |
| Tag GFP | - | 26.9 |
| Tag V5 | GKPIPNPLLGLDST | 1.4 |
| Rusa jantan | KETAAAKFERQHMDS | 1.8 |
| tanda elektronik | GAPVPYPDPLEPR | 1.4 |
Informasi Produk
| Jenis | Nama Produk | Berat Molekul (KDa) | Nomor Produk |
| Memuat Antibodi Kontrol | β-aktin, antibodi monoklonal tikus | 42 | 30101ES |
| β-aktin, pAb kelinci | 42 | 30102ES | |
| GAPDH (Klon:1A6), antibodi monoklonal tikus | 36 | 30201ES | |
| GAPDH, pAb kelinci | 36 | 30202ES | |
| α-Tubulin, antibodi monoklonal tikus | 50-55 | 30304ES | |
| β-Tubulin, antibodi monoklonal tikus | 50-55 | 30301ES | |
| β-Tubulin, pAb Kelinci | 50-55 | 30302ES |