1 Prinsip kerja genetisomisin

Genetomycin (Geneticin, G418) adalah antibiotik aminoglikosida yang menghambat sintesis protein dengan cara memblokir perpanjangan rantai peptida dengan mengikat ribosom 70S dan 80S pada sel prokariotik dan eukariotik. Mekanisme ini bersifat toksik terhadap sel bakteri, ragi, tumbuhan, dan mamalia. Ketika sel berhasil ditransfeksi dan diintegrasikan dengan gen resistensi neomisin (seperti gen neo), aminoglikosida fosfotransferase (APH (3) II) yang dikodekan oleh gen dapat memodifikasi G418 secara kovalen untuk menonaktifkannya, sehingga memberikan resistensi terhadap sel yang tumbuh dalam media selektif yang mengandung G418.

Dalam pengujian genetik molekuler, G418 adalah salah satu yang umum digunakan untuk transfeksi yang stabil.

2 Aplikasi genomisin

2.1 Penyaringan Garis Sel Transfeksi yang Stabil

• G418 digunakan untuk menyaring sel yang mengandung gen resistensi (misalnya, gen neo) dengan menghambat sintesis protein. Aminoglikosida fosfotransferase yang dikodekan oleh gen resistensi menonaktifkan G418, yang memberikan resistensi sel terhadap G418. Biasanya, kisaran penyaringan sel mamalia adalah 200 – 2000 μg/mL, dengan konsentrasi kerja yang paling umum digunakan adalah 100 – 700 μg/mL. Jika sel tumbuhan adalah 10-100 μg/mL dan sel ragi adalah 500-1000 μg/mL, berikut adalah konsentrasi yang digunakan untuk beberapa jenis sel yang menggunakan G418 sebagai referensi.

Sel	Aplikasi	Konsentrasi aktivasi geneomycin (μg/mL)	Karya yang dikutip
Spesies Mucor	a) Dikulturkan dalam media pertumbuhan b) Dikulturkan pada bakteri beku-kering	a) 10 μg/ml b) 30 μg/ml	Hirth, dkk., Prosiding Akademi Ilmu Pengetahuan Nasional, v.79, 7356-7360 (1982).
mamalia	a) Untuk penyaringan b) Untuk mempertahankan pertumbuhan	a) 400 -1000 μg/ml b) 200 μg/ml	Canaani dan Berg, Prosiding Akademi Ilmu Pengetahuan Nasional, v.79, 5166-5170 (1982).
Tanaman	a) Untuk penyaringan b) Untuk mempertahankan pertumbuhan	a) 25-50 μg/ml b) 10 μg/ml	Ursic, dkk., Biokimia. Biofisika. Komunikasi Res., ayat 101:3, 1031-1037 (1981).
Ragi	a) Untuk penyaringan b) Untuk mempertahankan pertumbuhan	a) 500 μg/ml b) 125-200 μg/ml	Jimenez dan Davies, Alam, jilid 287, 869-871 (1980).
Bakteri	Untuk penyaringan	16 mg/ml	Waitz, dkk., Agen Antimikroba Kemoterapi, ayat 6:5, 579-581 (1974).

2.2 Knockout Gen dan Transfer Gen

• Dalam penghapusan gen, G418 dapat digunakan untuk menyaring sel yang berhasil menghapus gen target. Dalam transfer gen, G418 memfasilitasi integrasi gen asing ke dalam genom sel inang.

2.3 Seleksi Resistensi dalam Kultur Sel

• Selama kultur sel, G418 digunakan untuk menyaring sel yang resistan terhadap antibiotik, yang sering membawa gen resistensi spesifik.

3 Prosedur eksperimental yang relevan untuk geneomisin

3.1 Persiapan Larutan Stok G418 (50 mg/mL, Konsentrasi Aktif)

1) Konversi Satuan Aktivitas

Konversi menggunakan rumus: (1000/A0) × A1 = A2, di mana A0 adalah potensi G418, yang bervariasi menurut batch. Lihat laporan kendali mutu untuk batch terkait atau label pada botol. A1 adalah konsentrasi aktif G418 yang diinginkan untuk disiapkan. A2 adalah konsentrasi bubuk terhadap volume aktual yang akan ditimbang.

Misalnya, jika batch G418 memiliki potensi 750 U/mg dan Anda ingin menyiapkan konsentrasi aktif 50 mg/mL, maka konsentrasi bubuk aktual yang harus disiapkan adalah 1000/750 × 50 mg/mL = 66,67 mg/mL.

Jika menyiapkan 10 mL larutan stok G418 (konsentrasi aktif, 50 mg/mL), maka diperlukan 666,7 mg bubuk.

• Sterilisasi dan Penyimpanan

Berdasarkan berat bubuk aktual yang diperoleh dari konversi di atas, tambahkan ke 10 mL air deionisasi steril hingga larut sempurna.

Pertama, basahi filter jarum suntik 0,22 μm dengan 5 mL air deionisasi steril, buang semua air. Kemudian saring menggunakan filter ini untuk mensterilkan dan alikuot ke dalam volume kecil untuk sekali pakai (misalnya, 1 mL) dan simpan pada suhu -20°C agar stabil selama 1 tahun.

3.2 Penetapan Kurva Pembunuhan

1) Hari pertama: Tanam sel yang belum ditransformasi pada kepadatan sel 20-25% dalam pelat kultur yang sesuai dan inkubasi semalam pada suhu 37°C, CO₂.

2) Tetapkan gradien konsentrasi dalam rentang yang sesuai berdasarkan jenis sel, pilih setidaknya 6 konsentrasi (G418 paling aktif terhadap sel dalam fase pembelahan, jadi sel harus dikultur selama beberapa waktu sebelum menambahkan G418), misalnya, untuk sel mamalia, tetapkan 0, 50, 100, 200, 400, 800, 1000 μg/mL.

3) Hari kedua: Buang media kultur lama dan ganti dengan media baru yang disiapkan berisi konsentrasi obat yang sesuai, dengan tiga kali ulangan untuk setiap konsentrasi.

4) Ganti dengan media baru yang mengandung obat setiap 3-4 hari.

5) Lakukan penghitungan sel hidup pada interval tertentu (misalnya, setiap 2 hari) untuk menentukan konsentrasi yang tepat yang mencegah pertumbuhan sel yang tidak ditransfeksi. Pilih konsentrasi terendah yang dapat membunuh sebagian besar sel dalam jumlah hari yang ideal (biasanya 7-10 hari) sebagai konsentrasi kerja untuk penyaringan garis sel yang ditransfeksi secara stabil.

3.3 Penyaringan Sel Transfeksi yang Stabil

• G418 Geneticin (60220ES) yang disediakan oleh Yisheng Biotech memiliki kemanjuran ≥720 U/mg, kemurnian ~98%, dan stabilitas batch, dengan harga hampir sepertiga dari produk G418 perusahaan lain.
• Media penyaringan yang berisi obat diganti setiap 3-4 hari.
• Pembentukan klon sel (koloni) diamati dan dinilai setelah 7 hari seleksi. Koloni mungkin memerlukan waktu seminggu atau lebih untuk terbentuk, tergantung pada jenis sel inang, transfeksi, dan kemanjuran penyaringan.
• 5-10 klon resistan dipilih dan dipindahkan ke pelat kultur sel berukuran 35 mm dan selanjutnya dipelihara dengan media penyaringan yang mengandung obat selama 7 hari.
• Setelah mengganti media kultur normal.

4 Rekomendasi produk

Genetika G418 (60220ES) disediakan oleh Yeasen Bioteknologi memiliki kemanjuran ≥720 U/mg, kemurnian ~98%, dan stabilitas batch, dengan harga hampir sepertiga dari produk G418 perusahaan lain.

Spesifikasi	S*	T*	Yeasen	Yeasen keuntungan
Kandungan (HPLC)	/	/	~98%	Kemurnian tinggi
Potensi (U/mg)	≥720 µg/mg	707-721 µg/mg	≥720 µg/mg	Efektivitas tinggi
Harga ($/5 g)	~1000	~1000	~200	Murahnya

5 Kasus Eksperimen

Pada E. coli, G69 dan G99 merupakan dua kelompok yang berbeda; konsentrasi genomisin masing-masing adalah 8 mg/L, 12 mg/L, dan 16 mg/L, dan konsentrasi minimum efektif adalah 16 mg/L, yang secara menyeluruh menghambat pertumbuhan bakteri lain-lain.