1. Apa itu sel dendritik (DC)?
Sel dendritik (DC) merupakan sel penyaji antigen (APC) yang paling efektif dalam tubuh manusia. DC merupakan satu-satunya APC yang mampu merangsang proliferasi sel T naif secara kuat. Jenis APC lainnya (seperti monosit, makrofag, sel B, dll.) hanya dapat merangsang sel T yang teraktivasi atau sel memori. Oleh karena itu, sel DC merupakan inisiator respons imun sel T adaptif dan memainkan peran yang sangat penting dalam imunitas tumor. Sel DC mengekspresikan molekul MHC-I dan MHC-II secara tinggi pada permukaannya dan memiliki penanda permukaan yang spesifik. Sel DC mengambil, memproses, dan merangsang sel T untuk mengaktifkan antigen, dan pada akhirnya menentukan arah diferensiasi sel T.
2. Sumber DC
Sel DC hadir dalam jumlah yang sangat sedikit di dalam tubuh. Diperlukan waktu yang lama untuk mengisolasi DC secara langsung dari tubuh dan hasil selnya sangat rendah, yang sangat membatasi penelitian dan penerapan DC. Namun, DC dapat dibedakan dan diinduksi dari sel prekursor DC di berbagai jaringan, seperti sel prekursor dalam cairan sumsum tulang, monosit dalam darah tepi, dan darah tali pusat.
Bagi manusia, karena darah tepi manusia adalah yang paling mudah diperoleh dan memiliki jumlah monosit terbanyak, metode yang paling umum digunakan adalah menginduksi DC dari sel mononuklear darah tepi manusia (PBMC). Untuk tikus, metode yang paling umum adalah menginduksi DC dari sel sumsum tulang, yaitu sel dendritik yang berasal dari sumsum tulang (BMDC).
Gambar 1. Diagram skema metode persiapan BMDC klasik
3. Metode Persiapan BMDC
Metode umum untuk menyiapkan BMDC tikus adalah:
3.1 Metode kultur BMDC klasik - Metode Inaba (dimodifikasi)
3.2 Persiapan BMDC skala besar - metode Sons
3.3 Persiapan BMDC skala besar - metode Lutz
3.1 [Metode kultur BMDC klasik] - Metode Inaba (ditingkatkan)
【Latar belakang】
A. Jumlah BMDC yang diperoleh dengan metode Inaba adalah 5-7 x 106/mouse;
B. Metode Inaba yang asli hanya menggunakan GM-CSF untuk menginduksi produksi BMDC. Meskipun BMDC yang diperoleh memiliki kemampuan stimulasi yang kuat dalam reaksi limfosit campuran, kematangan DC tidak sebaik induksi gabungan GM-CSF+IL-4. Oleh karena itu, metode yang disempurnakan selanjutnya sering kali menggunakan induksi gabungan GM-CSF+IL-4.
【Langkah-langkah budidaya】
3.1.1 Memperoleh Sel Sumsum Tulang Tikus
1) Tikus (berusia 6-10 minggu) dibunuh dengan dislokasi serviks, semua tulang paha dan tulang kering diangkat melalui pembedahan, dan jaringan otot di sekitar tulang dihilangkan sebanyak mungkin dengan gunting dan forsep.
[Catatan] Jangan merusak tulang.
2) Pindahkan tulang ke bangku bersih dan rendam dalam cawan kultur steril berisi alkohol 70% selama 2-5 menit untuk mendisinfeksi dan mensterilkan, lalu cuci dua kali dengan PBS steril.
3) Pindahkan tulang ke cawan kultur baru yang berisi PBS, potong kedua ujung tulang dengan gunting, lalu gunakan spuit untuk mengekstrak PBS. Masukkan jarum ke rongga sumsum tulang dari kedua ujung tulang, dan berulang kali siram sumsum tulang ke dalam cawan kultur hingga tulang berubah putih sepenuhnya.
4) Kumpulkan suspensi sumsum tulang dan saring fragmen kecil dan jaringan otot dengan jaring nilon 200-mesh.
5) Sentrifus filtrat pada 1200 rpm untuk 5 menit dan buang supernatannya.
6) Tambahkan 2 ml buffer lisis sel darah merah amonium klorida (1x), suspensikan kembali sel, dan inkubasi pada suhu kamar selama 3-5 menit, sampai 10 menit
7) Tambahkan 10 ml PBS untuk menetralkan efek buffer lisis, lalu sentrifus pada 1200 rpm selama 5 menit dan buang supernatannya.
8) Cuci sekali dengan PBS, lalu suspensikan kembali sel-sel tersebut dalam medium kultur RPMI1640 yang mengandung 10% FBS. Sel-sel sumsum tulang tikus telah diperoleh.
Persiapan larutan lisis sel darah merah amonium klorida:
A. Siapkan larutan penyimpanan 10x sebagai berikut: timbang 82,9 g-n-h4Cl, 10,0g KHCO33 dan 0,37g Na2EDTA, larutkan dalam 1L air suling, saring dengan 0,22 membran filter μm untuk sterilisasi, dan simpan pada suhu 4℃ selama 6 bulan;
B. Sebelum digunakan, encerkan larutan penyimpanan 10x dengan air suling steril 1:9 untuk larutan kerja 1x.
[Catatan] Karena larutan lisis sel darah merah amonium klorida memiliki efek berbahaya tertentu pada sel sumsum tulang, waktu hemolisis harus dipersingkat sebanyak mungkin.
3.1.2 Induksi diferensiasi BMDC
1) Hitung sel sumsum tulang tikus yang diperoleh pada langkah 1 dan sesuaikan konsentrasi sel menjadi 0,5-1× 106/ml dengan media kultur lengkap RPMI 1640 yang mengandung 10% FBS.
2) Masukkan ke dalam plat kultur 24 sumur, 1 ml sel per sumur, tambahkan GM-CSF tikus rekombinan (20 satuan liter/ml) dan IL-4 (10 satuan liter/ml), dan kultur pada suhu 37℃, 5% CO2 inkubator. Ini adalah hari ke-0 kultur.
【Catatan】
A. Umumnya sekitar 4-5x107 Sel sumsum tulang dapat dipanen dari satu tikus, sehingga setidaknya 40-50 sumur dari pelat 24 sumur dapat ditanam.
B. Kisaran konsentrasi GM-CSF dan IL-4 adalah 20-50 satuan liter/ml dan 10-40 satuan liter/ml, masing-masing.
3) Kocok perlahan pelat kultur setiap 2 hari, lalu ganti 3/4 volume dengan media kultur baru dan isi kembali sitokin.
4) Antara hari ke-5 dan ke-8, tiup media kultur secara perlahan untuk mengumpulkan sel-sel yang tersuspensi dan sel-sel yang melekat longgar.
5) Sentrifus pada 1200 rpm untuk 5 menit dan buang supernatannya.
6) Suspensikan kembali sel dalam medium kultur lengkap RPMI 1640 yang mengandung 10% FBS dan hitung jumlahnya, kemudian sesuaikan konsentrasi sel menjadi 1×106/ml, dan tambahkan GM-CSF tikus rekombinan (20 satuan liter/ml) dan IL-4 (10 satuan liter/ml).
7 ) Letakkan sel dalam cawan kultur 100 mm (maksimal 10 ml per cawan) atau cawan kultur 6 sumur (2 m/sumur).
8) Lanjutkan kultur pada suhu 37℃, 5% CO2 inkubator selama 1-2 hari.
9) Kumpulkan sel yang tersuspensi, yang merupakan BMDC yang lebih matang.
【Catatan】
A. Langkah 2.5-2.8 adalah langkah pelapisan ulang yang tujuannya adalah membuat BMDC yang diperoleh pada langkah 2.4 lebih matang.
B. Dalam waktu 3 jam setelah penanaman ulang, banyak sel berduri yang melekat dapat terlihat bermigrasi dari gugusan DC, dan setelah 1 hari kultur, sel-sel yang melekat ini akan terlihat terpisah dari dasar pelat kultur, dan banyak DC khas dapat terlihat mengambang di media kultur.
3.1.3 Pematangan penuh BMDC
[Catatan] BMDC yang diperoleh pada langkah 2 bukanlah DC yang sepenuhnya matang. Jika Anda ingin memperoleh DC yang sepenuhnya matang, Anda masih perlu diinduksi oleh LPS, CD40L atau TNF-a.
1) Sentrifus BMDC yang diperoleh pada langkah 2.4 atau 2.9 pada 1200 rpm untuk 5 menit dan buang supernatannya.
2) Suspensikan kembali endapan dengan media kultur lengkap RPMI yang mengandung GM-CSF tikus rekombinan (20 satuan liter/ml) dan IL-4 (10 satuan liter/ml), dan sesuaikan konsentrasi sel menjadi 1×106/ml setelah penghitungan.
3) Tambahkan ke pelat kultur 24 sumur dan tambahkan penginduksi pematangan seperti TNF-α (250 Satuan unit/ml), LPS (1 μg/mL), atau CD40L (1 (μg/ml).
4) Budaya dalam suhu 37℃, 5% CO2 inkubator selama 2 hari.
5) Kumpulkan sel-sel yang tersuspensi dan sel-sel yang tumbuh melekat longgar pada dinding, yang merupakan sel dendritik dewasa.
3.2【Metode produksi massal BMDC】-Metode Anak
【Latar belakang】
A. Metode ini dapat memperoleh 30-40×106 DC/tikus dalam waktu 7 hari, yang berarti 7-10 kali lipat dari metode klasik Inaba. Setelah DC disentrifugasi melalui gradien metrizamide 14,5%, kemurniannya (yaitu sel CD11c+/I-Ab+) dapat mencapai 85-95%.
B. Kemampuan endositosis DC yang diperoleh dengan metode ini lebih lemah dibandingkan dengan metode klasik Inaba, tetapi jumlah IL-12p70 yang disekresikan serupa.
C. DC yang diperoleh dengan metode ini memiliki kemampuan stimulasi yang lebih kuat dalam reaksi limfosit campuran daripada metode klasik Inaba.
D. DC yang diperoleh dengan metode ini dapat menginduksi respons sel T spesifik yang lebih kuat.
yaitu. Singkatnya, metode Son dapat memperoleh BMDC yang lebih banyak dan lebih matang daripada metode klasik.
【Langkah-langkah budidaya】
3.2.1 Memperoleh sel sumsum tulang tikus
Lihat langkah-langkah terkait dalam metode Inaba (yang dimodifikasi).
3.2.2 Persiapan BMDC dalam jumlah besar
1) Hitung sel sumsum tulang tikus yang diperoleh pada langkah 1 dan sesuaikan konsentrasi sel menjadi 2×105/ml dengan media kultur lengkap RPMI 1640 yang mengandung 10% FBS.
2) Sebarkan ke dalam pelat kultur 6 sumur, 5 ml sel per sumur, tambahkan GM-CSF tikus rekombinan (1000 Satuan unit/ml) dan IL-4 (1000 Satuan unit/ml), dan kultur pada suhu 37℃, 5% CO2 inkubator.
3) Pada hari ke-4 kultur, suplemen sistem kultur dengan GM-CSF tikus rekombinan (1000 Satuan unit/ml) dan IL-4 (1000 Satuan unit/ml).
4) Kumpulkan DC pada hari ke 7 kultur, suspensikan kembali dengan 2-4 ml media kultur lengkap RPMI 1640, tambahkan 14,5% (b/v) mepanema ke dalam volume yang sama, dan sentrifus pada suhu ruangan selama 20 menit. min pada 1200xg.
5) Kumpulkan lapisan tengah dan cuci tiga kali dengan media kultur lengkap RPMI 1640 untuk penggunaan selanjutnya.
[Catatan] DC saat ini adalah BMDC yang belum matang. Jika Anda ingin mematangkannya lebih lanjut, silakan lanjutkan ke langkah 3.
3.2.3 Kematangan penuh BMDC
1) Dilapisi ulang BMDC yang dikumpulkan pada langkah 2.4, dan ditambahkan GM-CSF tikus rekombinan (1000 Satuan unit/ml) dan IL-4 (1000 Satuan unit/ml), serta LPS (1-10 μg/ml) ke sistem budaya
2) Dikulturkan dalam suhu 37℃, 5% CO2 inkubator selama 2 hari untuk mendapatkan BMDC matang.
3.3【Metode persiapan massa BMDC】-Metode Lutz
【Latar belakang】
A. Metode Lutz mirip dengan metode Son, dan kedua metode dapat menyiapkan BMDC dalam jumlah besar, tetapi metode Lutz lebih banyak digunakan daripada metode Son.
B. Metode ini dapat memperoleh BMDC lebih besar, hingga 1-3 x 108 DC/mouse, dan kemurniannya bisa mencapai 90-95%;
C. Konsentrasi sitokin yang digunakan pada metode ini jauh lebih rendah dibandingkan dengan metode Son, hanya 200 Satuan unit/ml, dan turun menjadi 30-100 Satuan unit/ml dari hari ke 8 sampai hari ke 10 kultur, yang dapat sangat menghemat biaya reagen;
D. Perbedaan terbesar antara metode ini dengan metode klasik Inaba dan metode Son adalah bahwa sel sumsum tulang dikulturkan dalam cawan kultur bakteri (cawan Petri) dan bukan dalam pelat kultur sel. Inaba menjelaskan bahwa cawan kultur bakteri tidak mudah bagi makrofag dalam sumsum tulang untuk menempel pada dinding, sehingga menghambat perkembangan makrofag dan menghindari efek penghambatan makrofag pada pematangan DC. Ini mungkin menjadi alasan utama mengapa metode ini dapat memperoleh sejumlah besar BMDC pada kepadatan pelapisan yang lebih rendah.
yaitu. Namun, waktu kultur metode ini relatif lama, yaitu 10-12 hari. Di satu sisi, hal ini dilakukan untuk memperoleh lebih banyak BMDC. Di sisi lain, sebagian besar granulosit dan limfosit sulit bertahan hidup dalam waktu yang lama, sehingga kemurnian BMDC yang akhirnya diperoleh dapat ditingkatkan;
F. Metode ini hanya menggunakan GM-CSF untuk kultur induksi, dan BMDC yang diperoleh mengandung DC yang belum matang dan matang. Untuk lebih meningkatkan kematangan, LPS atau TNF-α perlu digunakan selama 1-2 hari induksi lagi, dan kandungan sel DC yang matang akan mencapai 50-70%.
【Langkah-langkah budidaya】
3.3.1 Mendapatkan sel sumsum tulang tikus
Lihat langkah terkait dalam metode Inaba (yang dimodifikasi), dan perhatikan bahwa langkah hemolisis harus dihilangkan.
3.3.2 Persiapan BMDC skala besar
1) Hitung sel sumsum tulang tikus yang diperoleh pada langkah 1 dan sesuaikan konsentrasi sel menjadi 2×105/ml dengan media kultur lengkap RPMI 1640 yang mengandung 10% FBS;
2) Sebarkan ke dalam cawan kultur bakteri 100mm (Petri Dish), 10 ml sel per cawan, dan tambahkan GM-CSF tikus rekombinan (200 Satuan unit/ml), dan kultur pada suhu 37℃, inkubator CO2 5%;
[Catatan] Cawan kultur bakteri yang digunakan di sini, bukan cawan kultur sel.
3) Pada hari ke 3 tambahkan 10 ml media kultur lengkap yang mengandung 20 satuan liter/ml tikus rekombinan GM-CSF ke dalam cawan kultur;
4) Pada hari ke 6 dan 8, ganti separuh medium yaitu kumpulkan medium kultur lama, suspensikan kembali pellet sel dengan medium kultur lengkap yang mengandung 20 satuan liter/ml tikus rekombinan GM-CSF setelah sentrifugasi, dan kemudian memasukkan suspensi sel kembali ke dalam cawan asli;
5) Pada hari ke 10, sel dapat dikumpulkan, yaitu BMDC.
3.3.3 Pematangan penuh BMDC
1) Kumpulkan sel yang tersuspensi dengan meniup DC secara perlahan pada hari ke 10 kultur menggunakan pipet, lalu sentrifus pada kecepatan 300xg selama 5 menit pada suhu ruangan;
2) Buang supernatan, suspensikan kembali pelet sel dengan 10 ml media kultur lengkap RPMI 1640, lalu sebarkan pada pelat kultur sel berukuran 100 mm;
3) Tambahkan tikus rekombinan GM-CSF (100 Satuan unit/ml) dan TNF-α (500 Satuan unit/ml), atau tikus rekombinan GM-CSF (100 Satuan unit/ml) dan LPS (1 (μg/ml);
4) Lanjutkan kultur pada suhu 37℃, 5% CO2 inkubator selama 1-2 hari.
4. Identifikasi BMDC
aku Pengamatan morfologi: Kebanyakan BMDC tumbuh dalam koloni, dan sel-selnya memiliki beberapa tonjolan dendritik, yang lebih jelas pada BMDC dewasa.
aku Analisis fenotipe sel: Flow cytometry digunakan untuk mendeteksi ekspresi molekul CD11c, CD40, CD80, CD86, MHC kelas II (IA/IE) pada permukaan sel DC. BMDC mengekspresikan molekul-molekul ini secara tinggi, dan ekspresi molekul-molekul ini pada BMDC yang sudah matang akan semakin meningkat.
aku Reaksi limfosit campuran (MLR): BMDC memiliki kemampuan stimulasi yang kuat, dan semakin tinggi kematangannya, semakin kuat kemampuan stimulasinya.
5. Bagaimana cara memilih penginduksi pematangan?
LPS, CD40L, dan TNF-α merupakan penginduksi pematangan yang umum digunakan dan efektif untuk DC manusia dan DC tikus. TNF-a memiliki kemampuan terlemah untuk menginduksi pematangan DC di antara ketiganya. LPS dan CD40L keduanya merupakan penginduksi kuat untuk pematangan penuh DC secara in vitro. Pematangan DC yang diinduksi oleh keduanya serupa, tetapi spektrum sitokin yang diinduksi berbeda. BMDC matang yang diinduksi CD40L menunjukkan kemampuan imunoregulasi terkuat secara in vivo, termasuk pembentukan respons imun tumor yang protektif dan terapeutik. Konsentrasi yang digunakan untuk menstimulasi pematangan penuh DC dengan LPS umumnya 1-10 μg/mL, tetapi sebenarnya 0,1 μg/mL memiliki efek yang sangat kuat, tetapi untuk tujuan asuransi, 1 Umumnya, μg/mL digunakan. Perlu dicatat bahwa molekul CD40L termasuk dalam keluarga ligan TNF, yang dicirikan oleh fakta bahwa molekul tersebut hanya dapat berfungsi setelah membentuk trimer. Oleh karena itu, yang terbaik adalah menggunakan protein trimer CD40L rekombinan untuk menstimulasi DC, yang akan memberikan efek yang baik. Jika monomer CD40L digunakan untuk menstimulasi DC, kematangannya tidak terlalu tinggi dalam kebanyakan kasus.
6. Pemilihan metode pelatihan
Tabel 1.Perbandingan tiga metode eksperimen umum untuk menyiapkan BMDC
| Parameter | Metode kultur BMDC klasik - Metode Inaba | Persiapan BMDC skala besar - Metode Son | Persiapan BMDC skala besar - metode Lutz |
| Jumlah kutipan di PubMed | 783 | 24 | 663 |
| Hemolisis sumsum tulang, lisis sel darah merah | YA | YA | TIDAK |
| Sumsum tulang pertama-tama membuang limfosit | YA | TIDAK | TIDAK |
| Penghapusan granulosit selama kultur | YA | TIDAK | TIDAK |
| Volume pelapisan awal sel sumsum tulang | 1 ml air | 15 ml air | 10 ml air |
| Inkubator | Pelat kultur sel 24 sumur | Plat kultur sel 6 sumur | Cawan kultur bakteri 100mm |
| Media kultur | RPMI 1640+10% FCS | ||
| Konsentrasi GM-CSF tikus | 200-1000 Satuan unit/ml | Konsentrasi awal yang ditambahkan adalah 125-1000 Satuan unit/ml Pada hari ke-4 dan ke-7, jumlah GM-CSF dan IL-4 yang cukup ditambahkan ke sistem kultur. | Konsentrasi awal yang ditambahkan adalah 200 Satuan unit/ml.3-100 Satuan unit/ml setelah hari ke 10 |
| Tikus IL-4 | Tak perlu | Membutuhkan，Konsentrasi sama dengan GM-CSF | Tak perlu |
| Metode pertukaran cairan | Pada hari ke-2 dan ke-4, buang 50%-75% media kultur lama (yang berisi sel) dan ganti dengan media kultur lengkap segar yang mengandung cukup GM-CSF. | / | Pada hari ke-3, volume yang sama dari medium kultur lengkap yang mengandung GM-CSF ditambahkan. Pada hari ke-6, ke-8 dan ke-10, setengah dari medium diganti. Medium kultur lama (yang mengandung sel) disedot, disentrifugasi, disuspensikan kembali dalam medium kultur lengkap baru yang mengandung GM-CSF dan kemudian dimasukkan kembali. |
| Waktu kultur sebelum lewat (ekspansi) | 6 hari | 7 hari | 10 hari |
| Waktu kultur setelah lewatnya (pematangan) | 2 hari | Tidak ada | 1-2 hari |
| Induksi kematangan penuh | TNF-α(250 Satuan unit/ml) | LPS (1-10) (mg/ml) | TNF-α(250 Satuan unit/ml)atau LPS(1 (mg/ml) |
| Waktu panen sel DC | 7-8 hari | 7-8 hari | 10-13 hari |
| Kemurnian DC | Hari ke 8: Bahasa Indonesia:60-70% | Hari ke 7: Bahasa Indonesia:85-95% | Hari ke 10-12: Bahasa Indonesia:80-90% |
| Produksi DC/tikus | (5-7)×106 | (3-4)×107 | (1-3)×108 |
Nomor telepon 7. Reagen kultur DC yang direkomendasikan
| Nama Produk | Kucing | Ukuran |
| 91108Bahasa Inggris | 5 μg/50 μg/100 ug/500 mikrogram | |
| 90144ES | 5 μg/50 μg/100 ug/500 mikrogram | |
| 90621ES | 5 ug/20 μg/50 ug/500 mikrogram | |
| 94016ES | 25 μg/100 ug/500 mikrogram |