Tentang T4 DNA Ligase
Namun, T4 DNA Ligase masih menghadapi beberapa tantangan dalam aplikasi praktis, termasuk stabilitas yang buruk, ligasi adaptor-adaptor yang tinggi, atau hasil pustaka DNA yang rendah. Masalah-masalah ini dapat menyebabkan berkurangnya efisiensi eksperimen, penurunan kualitas data, pengulangan hasil eksperimen yang buruk, dan kemurnian produk yang rendah, sehingga memengaruhi efektivitas keseluruhan eksperimen biologi molekuler dan keakuratan data sekuensing. Untuk mengatasi masalah-masalah ini, Yeasen, berdasarkan inovasi ZymeEditor milik anak perusahaannya Molefuture™ platform evolusi enzim telah melakukan evolusi enzim pada ligase DNA T4.
Gambar 1 Diagram Skema Prinsip Reaksi DNA Ligase T4[1]
Skrining eksperimental basah dan kering berulang untuk mendapatkan T4 DNA Ligase berkinerja tinggi
DNA ligase T4, enzim ligase yang bergantung pada ATP, terdiri dari domain pengikat DNA heliks kompak (DBD), domain nukleotidiltransferase (NTase), dan domain lipatan OB. Berdasarkan struktur proteinnya, Yeasen'S tim menganalisis residu yang mencakup jarak 5 hingga 20Å di sekitar substrat DNA, diikuti oleh penyaringan in silico dan analisis struktur-fungsi menggunakan alat komputasi canggih. Selama proses ini, tim mengamati sebuah loop fleksibel yang terletak jauh dari kantong aktif. Dipandu oleh perhitungan energi, tim pemotongan yang dirancang di wilayah loop ini, dengan hipotesis bahwa hal itu mungkin tidak berdampak signifikan pada fungsi ligasi tetapi dapat memengaruhi stabilitas struktural secara keseluruhan. Lebih jauh, tim menyelaraskan urutan konsensus untuk merancang mutan, menggabungkan analisis ini dengan pertimbangan struktural-fungsional, seperti yang diilustrasikan pada gambar di bawah.
Gambar 2 Struktur DNA Ligase T4
Selain desain rasional, evolusi terarah dari ligase DNA T4 dilakukan dengan metode MTPS dengan menyaring stabilitas, aktivitas, dan aktivitas residual. Dan pustaka lebih dari 104 mutan disaring. Setelah analisis menyeluruh terhadap data mutasi, kandidat yang menjanjikan dipilih untuk pemurnian dan pengujian ketat. Kemudian semua pemenang yang diperoleh melalui desain rasional dan evolusi terarah menjalani karakterisasi terperinci setelah pemurnian yang disempurnakan, yang meliputi penilaian aktivitas, stabilitas, ligasi diri adaptor, ligasi diri fragmen DNA, dan hasil DNA. Berdasarkan mutan G1, tim melakukan pengocokan DNA dan menggabungkan desain mutasi terarah untuk mendapatkan mutan luar biasa yang memenuhi beragam persyaratan aplikasi.
Dari Produk Mutasi ke Produk Pasar dengan Beberapa Putaran Validasi Pengurutan
Itu Editor ZymeWaktu Standar platform evolusi enzim telah berhasil mengembangkan mutan ligase DNA T4 dengan stabilitas termal tinggi, hasil perpustakaan tinggi, dan ligasi diri adaptor rendah melalui teknologi evolusi enzim. T4 DNA Ligase yang saat ini telah ditingkatkan telah berhasil diluncurkan - Hieff® Versatile T4 DNA Ligase (600 U/μL) (Cat#12996ES). Produk ini mengungguli T4 DNA Ligase tipe liar tradisional dalam hal efisiensi ligasi dan stabilitas termal, dan telah diverifikasi melalui pengurutan berthroughput tinggi, yang menjamin kualitas yang sangat baik.
Presentasi Data
1.Stabilitas Termal Lebih Tinggi
Mutasi T4 DNA Ligase dari Yeasen mengalami perlakuan panas pada suhu 42℃ selama 0, 2, dan 4 jam, dan dibandingkan dengan T4 DNA Ligase dari Vendor Q, N, A, dan T.Selanjutnya, perpustakaan DNA genom utuh dibangun menggunakan 1 µg gDNA sapi yang terfragmentasi dengan Yeasen Kit Konstruksi Pustaka DNA (Cat#12927ES) untuk membandingkan stabilitas termal DNA Ligase T4.
Gbr. 3 Uji Stabilitas Termal pada suhu 42℃
Hasil:
Stabilitas Termal: Yeasen ≈ Vendor N ≈ Vendor A > Vendor T > Vendor Q.
2.Hasil Perpustakaan Lebih Tinggi
Mutasi T4 DNA Ligase dari Yeasen diuji untuk hasil perpustakaan pada tingkat input DNA tinggi dan rendah, dibandingkan dengan T4 DNA Ligases dari Vendor Q, N, A, dan T. Yeasen Kit Konstruksi Pustaka DNA (Cat#12927ES) digunakan, dengan 1 µg dan 0,5 ng gDNA sapi terfragmentasi yang dimasukkan untuk membangun pustaka DNA.
Gambar 4 Analisis Hasil Pustaka DNA
Hasil:
Hasil Pustaka (1 µg gDNA): Yeasen > Vendor Q ≈ Vendor T ≈ Vendor A > Vendor N.Hasil Perpustakaan (0,5 µg gDNA): Yeasen ≈ Vendor Q ≈ Vendor A ≈ Vendor T > Vendor N.
3. Adaptor Bawah Self-Ligation
Mutasi T4 DNA Ligase dari Yeasen dibandingkan dengan T4 DNA Ligases dari Vendor Q, N, A, dan T untuk ligasi diri adaptor. Yeasen Kit Konstruksi Pustaka DNA (Cat#12927ES) digunakan, dengan 0 ng dan 0,5 ng gDNA sapi terfragmentasi yang dimasukkan untuk membangun pustaka DNA genom utuh.
Gambar 5 Data Self-Ligation Adaptor dengan Input gDNA 0 ng (kiri) dan 0,5 ng (kanan)
Hasil:
1) Laju Ligasi Mandiri Adaptor (0 ng gDNA): Vendor N > Yeasen > Penjual T > Penjual A > Penjual Q.
2) Tingkat Self-Ligasi Adaptor (0,5 ng gDNA): Yeasen > Vendor T > Vendor Q ≈ Vendor N > Vendor A.
Hubungi kami
Yeasen telah berhasil mengatasi keterbatasan ligase DNA T4 tradisional, menawarkan produk ligase DNA T4 yang unggul dalam hal stabilitas termal, hasil pustaka, dan ligasi mandiri adaptor. Dalam proses ini, perusahaan telah mengumpulkan pustaka mutan yang kaya, menyediakan berbagai pilihan bagi para peneliti untuk memenuhi berbagai kebutuhan eksperimen. Jika Anda tertarik dengan produk kami atau mutan ligase DNA T4, jangan ragu untuk menghubungi kami melalui metode berikut. E-mail: order1@yeasen.com (KITA)
Telepon: +1 240-472-6069 (AS)
Selain itu, Yeasen menawarkan berbagai seri produk T4 DNA ligase. Klik tautan produk untuk menanyakan informasi produk
Yeasen Seri Produk T4 DNA Ligase
| posisi produk | Nama Produk | Nomor Kucing. |
| Stabilitas termal tinggi dan tingkat self-ligation rendah | Hieff® Ligase DNA T4 Serbaguna (600 U/μL) | 12996ES |
| Ligasi cepat dan efisien, residu rendah, sangat cocok untuk kebutuhan deteksi patogen. | Ligase DNA T4 Cepat (400 U/µL) | 10299ES |
| model umum | Ligase DNA T4 Cepat (400 U/µL) | 10301ES |
Referensi
[1] Shuman S. Ligase DNA: Kemajuan dan Prospek[J]Jurnal Kimia Biologi, 2009, 284(26):17365-17369.
