RNase HII, juga dikenal sebagai RNase H2, adalah endoribonuklease yang secara khusus menargetkan dan memutus ikatan fosfodiester pada ujung 5' dari ribonukleotida soliter yang terletak di dalam heliks DNA untai ganda, menghasilkan gugus fosfat 5' dan gugus hidroksil 3' (Gbr. 1). Enzim ini menunjukkan aktivitas pembelahan minimal terhadap RNA untai tunggal dan tidak aktif terhadap DNA untai ganda (dsDNA) dan DNA untai tunggal (ssDNA). Secara fungsional aktif dalam kisaran suhu 50°C hingga 75°C, RNase HII mencapai kinerja puncak pada suhu antara 70°C dan 75°C. Dengan memanfaatkan kemampuan uniknya untuk melakukan pembelahan tertarget di satu lokasi pada lokasi DNA tempat ribonukleotida terintegrasi, tanpa memengaruhi dsDNA atau ssDNA, RNase HII berfungsi sebagai "pemicu" presisi untuk inisiasi reaksi, termasuk aktivasi dan ekstensi primer, untuk mencapai amplifikasi spesifik. Enzim ini memainkan peran penting dalam PCR bergantung RNase H (rhPCR), teknologi amplifikasi isotermal termediasi loop (LAMP), dan degradasi komponen RNA dalam fragmen Okazaki.

一. PCR yang bergantung pada RNase H(PCR-Rh)
rhPCR menggabungkan RNase HII dan primer rhPCR tertutup yang dirancang khusus ke dalam proses PCR. Pendekatan ini memanfaatkan sifat unik RNase HII untuk menghidrolisis RNA secara selektif dalam hibrida DNA-RNA, sambil membiarkan ikatan fosfodiester dalam DNA dan RNA untai tunggal atau untai ganda tetap utuh. Hasilnya, RNase HII hanya mencerna hibrida DNA-RNA dan memungkinkan ekstensi primer ketika primer tersebut benar-benar komplementer dengan urutan DNA target. Tindakan yang ditargetkan ini secara signifikan meningkatkan akurasi reaksi. RNase HII adalah satu-satunya enzim yang mampu memulai penghilangan ribonukleotida secara tepat tanpa menyebabkan mutasi dengan membelah pada ujung 5' asam ribonukleat. Karena spesifisitas, sensitivitas, dan reproduktifitasnya yang tinggi, rhPCR menawarkan keuntungan tersendiri dalam aplikasi seperti deteksi polimorfisme nukleotida tunggal (SNP), pengetikan gen, deteksi simultan beberapa target, dan analisis asam nukleat lingkungan.

Rute Teknis

1. Desain Primer

Desain primer harus memastikan bahwa suhu leleh setelah pemotongan lebih tinggi daripada suhu pemanasan untuk memastikan bahwa primer terikat secara stabil pada templat selama siklus PCR. Primer rhPCR terdiri dari tiga bagian:

1）Segmen DNA 5': Panjangnya sebanding dan persyaratan suhu leleh (Tm) dengan primer PCR standar, ia dapat secara efektif berpasangan dan memanjang dari DNA cetakan setelah dipotong oleh enzim RNase HII.

2）Satu basa RNA: menyediakan tempat pemotongan untuk RNase HII.

3）Segmen DNA 3': Panjang empat atau lima basa dengan penghambat, biasanya molekul pendek yang tidak dapat diperpanjang seperti propilen glikol, yang mencegah perpanjangan DNA polimerase sampai penghambat dihilangkan.

2.Pemotongan dan Ekstensi

Pada awal reaksi rhPCR, DNA primer dan cetakan bebas. Ketika primer mengikat cetakan heterodupleks RNA:DNA tertentu, sisi basa RNA 5' dari primer yang diblokir dikenali dan dipotong oleh enzim RNase HII, meninggalkan oligonukleotida DNA dengan gugus 3'-hidroksil, yang menyediakan titik awal bagi DNA polimerase untuk berkembang. Ini diikuti oleh proses amplifikasi PCR konvensional.

Gambar 2. Diagram prinsip rhPCR ^[1]

Ya.Amplifikasi isotermal yang dimediasi loop (LAMP)

Amplifikasi isotermal termediasi loop (LAMP) merupakan metode sederhana dan cepat untuk amplifikasi gen yang dapat mengamplifikasi asam nukleat dalam kondisi isotermal dalam waktu singkat. Namun, karena dimulainya aktivitas DNA polimerase selama persiapan pada suhu ruangan, ketidakcocokan non-spesifik terbentuk, yang dapat menyebabkan sejumlah kecil kesalahan pemasangan dan dimer primer, yang menyebabkan kontaminasi kecil yang dapat mengakibatkan positif palsu.
Penerapan RNase HII pada sistem amplifikasi LAMP dapat secara efektif mengatasi masalah positif palsu dalam teknologi LAMP, memperluas penerapannya dalam diagnostik klinis. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar 3, metode LAMP yang diaktifkan oleh primer (PA-LAMP) menggunakan RNase HII, ketika primer berpasangan dengan ssDNA target, enzim RNase HII secara spesifik membelah RNA pada primer, mengaktifkannya dan memungkinkan ekstensi primer, mencapai amplifikasi spesifik dan secara efektif mengurangi positif palsu dalam sistem.

Yeasen RNAse HII

YeasenRNase HII dari ' (Kucing#14539) berasal dari Pyrococcus abysidia, Pa, dan bebas dari kontaminasi nuklease, enzim penjebol, dan residu RNase, dengan kontaminasi DNA inang yang rendah, sehingga secara efektif mengurangi positif palsu dalam sistem. YeasenRNase HII sangat tahan panas, mempertahankan aktivitasnya bahkan setelah 30 menit pada suhu 95°C, membuatnya kompatibel dengan berbagai sistem reaksi rhPCR dan juga cocok untuk LAMP dan aplikasi lainnya.

1. Bakteri E. coli residu DNA genomik < 0,5 salinan/100 U

Deteksi Bakteri E.coli residu DNA genomik pada berbagai batch RNase HII menunjukkan bahwa residu DNA genomik inang YeasenRNase HII jauh di bawah 0,5 salinan/100 U.

Gambar 4. Deteksi Bakteri E.coli residu DNA genomik

2. Uji Tahan Panas 95°C

Setelah pemanasan RNase HII pada suhu 95°C selama 0 hingga 45 menit, aktivitas enzim RNase HII diuji. Hasil menunjukkan bahwa hampir tidak ada kehilangan aktivitas enzim dalam YeasenRNase HII bahkan setelah 45 menit pemanasan.

Gambar 5. Uji ketahanan panas 95°C

3. Tidak ada residu eksonuklease, enzim Nicking, atau RNase (dosis 1 U)

Inkubasi 1 U dari berbagai batch RNase HII dengan substratnya masing-masing DNA/RNA pada suhu 37°C selama 4 jam, hasil elektroforesis gel agarosa menunjukkan bahwa tidak ada eksonuklease, enzim penorehan, atau residu RNase dalam RNase HII.

Gbr. 6.Hasil deteksi eksonuklease, enzim nicking, dan residu RNase

Produk Terkait yang Direkomendasikan

Aplikasi Produk	Nama Produk	Nomor Katalog
rhPCR、LAMPU	RNase HII (2 U/μL) RNase HII, Bebas Gliserol (2 U/μL)	14539ES 14541ES
PCR-Rh	Hieff® Taq DNA Polimerase	10101ES
RT-LAMPU	Bahasa Indonesia: Hieff® Bst Plus DNA Polimerase (40 U/μL)	14402ES
	Hifair® Ⅲ Transkriptase Terbalik	11111ES

Referensi

[1] Dobosy JR, Rose SD, Beltz KR, Rupp SM, Powers KM, Behlke MA, Walder JA. PCR bergantung RNase H (rhPCR): peningkatan spesifisitas dan deteksi polimorfisme nukleotida tunggal menggunakan primer yang dapat dibelah dan diblokir. BMC Biotechnol. 10 Agustus 2011;11:80. doi: 10.1186/1472-6750-11-80.

[2] Du WF, Ge JH, Li JJ, dan lain-lain. Deteksi mutasi nukleotida tunggal dengan spesifisitas tinggi dan satu langkah melalui amplifikasi isotermal yang dimediasi loop yang dapat diaktifkan oleh primer (PA-LAMP)[J].Analytica chimica acta, 2019(1050-):1050.DOI:10.1016/j.aca.2018.10.068.