Gambar 1. Diagram skematis DNase I yang membelah dsDNA dengan adanya Mg²⁺ dan Mn²⁺

DNase I umum utamanya dimurnikan dari pankreas sapi atau merupakan enzim rekombinan. Dibandingkan dengan DNase I yang dimurnikan dari pankreas sapi, DNase I rekombinan memiliki kadar RNase endogen yang relatif lebih rendah atau dapat diformulasikan sebagai produk bebas RNase, sehingga lebih cocok untuk aplikasi yang sensitif terhadap RNase, seperti penghilangan DNA dari sampel RNA.

Aplikasi

Mengenai aplikasi, DNase I terkenal karena penggunaannya dalam percobaan yang berkaitan dengan pemeliharaan integritas RNA, seperti mengekstraksi RNA yang bebas dari DNA, menyiapkan templat RNA tanpa gDNA sebelum transkripsi balik, dan mendegradasi templat DNA setelah transkripsi in vitro. Selain itu, DNase I dapat digunakan untuk mencerna probe DNA dalam penghilangan rRNA, untuk pelabelan DNA melalui translasi nick, menganalisis interaksi DNA-protein menggunakan metode footprinting, menghasilkan pustaka DNA acak, mengurangi viskositas lisat sel atau ekstrak protein, mencerna adhesi sel sebagai aditif dalam kultur sel, dan membelah sebagian DNA genomik sebagai kontrol positif dalam uji TUNEL untuk deteksi apoptosis. Singkatnya, DNase I dapat digunakan dalam hampir semua aplikasi yang memerlukan pencernaan DNA secara enzimatik. Di bawah ini, pengantar singkat tentang beberapa aplikasi umum akan diberikan.

• Penghapusan gDNA sebelum ekstraksi RNA atau transkripsi balik

RNA, sebagai sampel yang umum dipelajari di laboratorium, sangat memengaruhi kualitas data eksperimen karena kualitasnya sendiri. Umumnya tidak mungkin untuk sepenuhnya menghindari residu gDNA selama proses ekstraksi RNA. Oleh karena itu, sebelum melakukan aplikasi hilir yang menantang (seperti analisis ekspresi mRNA, analisis transkriptom, dll.), biasanya direkomendasikan untuk memperlakukan sampel RNA dengan DNase I untuk mencerna residu gDNA. Pencernaan gDNA dapat dilakukan selama ekstraksi RNA, setelah ekstraksi RNA, atau sebelum transkripsi balik RNA.

Gambar 2. Proses penghapusan gDNA berbasis DNase I

• Penghapusan DNA template dalam transkripsi in vitro

Transkripsi in vitro (IVT) terutama menggunakan DNA sebagai cetakan untuk menghasilkan RNA di bawah pengaruh substrat dan penyangga yang sesuai. RNA polimerase yang umum digunakan dalam proses ini meliputi T7, T3, dan SP6, yang bertanggung jawab untuk mengkatalisis sintesis RNA. Namun, produk RNA yang disintesis mungkin mengandung residu DNA, dan menghilangkan residu ini bermanfaat untuk eksperimen hilir.

Khususnya dalam proses pengembangan vaksin mRNA, menghilangkan residu DNA ini merupakan langkah krusial yang secara langsung memengaruhi kesulitan proses pemurnian selanjutnya dan kemurnian produk akhir.Untuk menghilangkan DNA cetakan secara efisien, DNase I biasanya digunakan untuk perawatan guna memastikan bahwa sampel RNA bebas dari residu DNA, suatu langkah yang membantu meningkatkan akurasi dan efisiensi percobaan secara keseluruhan.

Gambar 3: Proses transkripsi in vitro menggunakan plasmid linierisasi sebagai templat^[4]

• Penghapusan rRNA dalam konstruksi dan pengurutan pustaka RNA

Pada organisme, rRNA sangat melimpah dan sangat terkonservasi, yang tidak terlalu penting untuk memperoleh penelitian informasi biologis. Namun, 95% dari total RNA yang diekstraksi selama percobaan adalah rRNA manusia, dan keberadaan rRNA ini dapat mengganggu deteksi RNA target. Oleh karena itu, dalam persiapan dan pengurutan pustaka RNA, rRNA biasanya dihilangkan terlebih dahulu. Saat ini, metode utama untuk menghilangkan rRNA adalah pencernaan RNAase, dan operasi utamanya Langkah-langkah dan prinsipnya adalah sebagai berikut:

1. Ekstrak Total RNA;
2. Hibridisasikan probe DNA untai tunggal dengan molekul rRNA (Catatan: Mendesain dan mensintesis probe DNA untai tunggal spesifik rRNA);
3. RNase H mendegradasi rRNA hibridisasi;
4. DNase I mendegradasi probe DNA;
5. rRNA berhasil dihilangkan, meninggalkan templat RNA non-rRNA.

Gambar 4: Diagram skema prinsip penghilangan rRNA berdasarkan metode enzimatik^[5]

• Terjemahan Nick untuk pelabelan DNA

Penerjemahan Nick merupakan metode yang paling umum digunakan untuk memberi label pada probe asam deoksiribonukleat di laboratorium. Metode ini dicapai melalui aksi gabungan DNase I dan Bakteri E.coli DNA Polimerase I.

Prinsip utamanya adalah sebagai berikut:

1. Pertama, gunakan konsentrasi DNase I yang tepat untuk membuat beberapa torehan untai tunggal pada setiap untai DNA untai ganda yang akan diberi label, membentuk ujung hidroksil 3' pada lokasi torehan tersebut.
2. Kemudian, gunakan aktivitas eksonuklease 5'→3' dari koliDNA Polimerase I untuk menghilangkan nukleotida dari ujung 5' dari nick, sedangkan aktivitas polimerase 5'→3' dari Bahasa Indonesia: E. koli DNA Polimerase I memasukkan nukleotida berlabel ke ujung 3' torehan untuk memperbaikinya. Saat torehan bergerak sepanjang untai DNA, nukleotida berlabel dimasukkan ke dalam untai DNA yang baru disintesis.

Gambar 5: Diagram skema prinsip pelabelan DNA dengan translasi nick^[6]

• Percobaan pengujian jejak DNAse I

Uji jejak DNAse I merupakan metode yang tepat untuk mengidentifikasi lokasi pengikatan protein pengikat DNA pada molekul DNA. Prinsipnya adalah bahwa protein yang terikat pada fragmen DNA melindungi daerah yang terikat agar tidak terdegradasi oleh DNase I. Setelah pencernaan enzimatik, fragmen yang tersisa ("jejak") dapat digunakan untuk menentukan urutannya. Pada gambar gel, tidak ada pita yang sesuai dengan daerah tempat protein terikat.

Prinsip utamanya adalah sebagai berikut:

1. Beri label ujung untai tunggal dari molekul DNA untai ganda yang akan diuji.
2. Campurkan protein dengan DNA dan tambahkan jumlah DNase I yang sesuai untuk pencernaan enzimatik, membentuk fragmen DNA dengan panjang yang bervariasi.Jumlah enzim harus dikontrol untuk memastikan bahwa fragmen DNA yang berdekatan hanya berbeda satu nukleotida, dan kontrol tanpa protein tambahan harus disertakan secara paralel.
3. Hapus protein dari DNA, pisahkan DNA yang terdenaturasi dengan elektroforesis PAGE, dan lakukan autoradiografi untuk menginterpretasikan urutan nukleotida daerah tapak dengan perbandingan dengan kelompok kontrol.

Gambar 6: Diagram skema prinsip pengujian footprinting DNase I^[7]

Itu DNAse saya Panduan Pemilihan Bahasa Inggris Yeasen

Untuk memenuhi berbagai kebutuhan aplikasi, Yeasen penawaran rekombinan DNAse saya di dalam Bakteri E.coli, dan dapat menyediakan DNase I tingkat GMP untuk memenuhi persyaratan transkripsi mRNA in vitro dan aplikasi lainnya.

Posisi produk	Aplikasi	Nama Produk	nomor katalog
Bebas RNase	menghilangkan DNA dari preparat RNA dan protein	DNase I rekombinan (bebas RNase)	10325ES
Kelas GMP, Bebas RNase	Transkripsi mRNA secara in vitro	UCF.ME® Deoksiribonuklease I (DNase I) kelas GMP	10611ES

Referensi

[1] Ndiaye C, Mena M, Alemany L, dkk. Deteksi DNA HPV, mRNA E6/E7, dan p16INK4a pada kanker kepala dan leher: tinjauan sistematis dan meta-analisis[J]. The Lancet Oncology, 2014, 15(12): 1319-1331.

[2] Broccolo F, Fusetti L, Rosini S, dkk. Perbandingan beban DNA virus spesifik tipe HPV onkogenik dan deteksi mRNA E6/E7 dalam sampel serviks: hasil dari studi multisenter[J]. Jurnal virologi medis, 2013, 85(3): 472-482.

[3] Huang Z, Fasco MJ, Kaminsky L S. Optimalisasi penghapusan kontaminan DNA dari RNA oleh Dnase I untuk digunakan dalam RNA-PCR kuantitatif[J]. Bioteknik, 1996, 20(6): 1012-1020.

[4] Kang DD, Li H, Dong Y. Kemajuan mRNA transkripsi in vitro (IVT mRNA) untuk memungkinkan penerjemahan ke klinik[J]. Ulasan Pengiriman Obat Lanjutan, 2023, 199: 114961.

[5] Wiame I, Remy S, Swennen R, et al. Inaktivasi panas ireversibel DNase I tanpa degradasi RNA[J]. Bioteknik, 2000, 29(2): 252-256.

[6] Adolph S, Hameister H. Terjemahan nick in situ kromosom metafase dengan d-UTP berlabel biotin[J]. Genetika manusia, 1985, 69: 117-121.

[7] Song C, Zhang S, Huang H. Memilih metode yang cocok untuk mengidentifikasi asal replikasi dalam genom mikroba. Front Microbiol, 2015, 6: 1049.