Deoksiribonuklease I (DNase I) merupakan endonuklease, aplikasinya tidak hanya untuk menjaga integritas RNA tetapi juga untuk analisis jejak DNA, pembuatan pustaka DNA acak, pengurangan kekentalan dalam lisat sel atau ekstrak protein, dll. Singkatnya, DNase I dapat digunakan dalam hampir semua aplikasi yang memerlukan pembelahan DNA oleh enzim. Berikut ini adalah pengantar terperinci tentang DNase I dan aplikasi spesifiknya.

1. Apa itu DNase I?
2. DNase I untuk persiapan ekstraksi RNA bebas DNA
3. DNase I untuk transkripsi in vitro untuk menghilangkan DNA template
4. DNase I untuk penghapusan rRNA
5. DNase I untuk pelabelan DNA
6. Aplikasi lainnya
7. Panduan pemilihan produk DNase I

1. Apa itu DNase I?

Deoksiribonuklease I (DNase I) adalah endonuklease non-spesifik yang dapat mencerna DNA untai tunggal atau ganda, yang terdapat dalam berbagai jaringan dan cairan tubuh. Ia dapat menghidrolisis ikatan fosfodiester untuk menghasilkan mono- dan oligodeoksinukleotida yang mengandung gugus 5'-fosfat dan gugus 3'-OH. Kisaran pH kerja optimal DNase I adalah 7-8, aktivitasnya bergantung pada Ca2+, dan dapat diaktifkan oleh ion logam divalen seperti Mn2+, Mg2+, Zn2+, dll. Dengan adanya Mg2+, DNase I secara acak memotong setiap situs DNA untai ganda; dengan adanya Mn2+, DNase I dapat memotong DNA untai ganda di situs yang sama untuk membentuk ujung tumpul atau ujung lengket 1-2 nukleotida yang menjorok.

Gambar 1. Diagram skema pembelahan dsDNA oleh DNase I dengan adanya Mg2+ dan Mn2+.

Meskipun pembelahan DNase I secara umum dianggap sebagai pembelahan non-spesifik, DNase I lebih mungkin bekerja pada fragmen sekuens tertentu, seperti daerah alur minor, dan lebih rentan terhadap pembelahan sekuens purin-pirimidin. Namun, ketika DNase I bekerja pada dsDNA heterogen, keempat basa akan terbelah, dan efek pada basa tertentu tidak akan lebih dari 3 kali lebih besar daripada basa lainnya.

2. DNase I untuk persiapan ekstraksi RNA bebas DNA

Dalam percobaan biologi, langkah pertama adalah menyiapkan asam nukleat untuk mempelajari berbagai fungsi RNA. Akan tetapi, karena DNA dan RNA sering dilepaskan bersamaan selama proses lisis sel, interferensi pada keduanya tidak dapat dihindari, apa pun larutan ekstraksi yang digunakan, sehingga enzim tertentu perlu digunakan untuk menghilangkan interferensi tersebut. Untuk ekstraksi RNA berkualitas tinggi, DNase I digunakan untuk menghilangkan sisa DNA dari sampel.

DNase I dapat mendegradasi DNA untai ganda dan untai tunggal menjadi oligonukleotida dan nukleotida tunggal, dan DNA dalam produk preparasi RNA dapat didegradasi secara efektif. DNase I kemudian dinonaktifkan dengan pemanasan menggunakan stop buffer. Selama proses pemanasan, struktur jepit rambut molekul RNA dapat dibuka, yang memfasilitasi masuknya RNA secara langsung ke dalam proses transkripsi balik.
Kualitas RNA akan secara langsung memengaruhi data eksperimen hingga tingkat yang besar. Secara umum, residu gDNA tidak dapat sepenuhnya dihindari selama ekstraksi RNA, oleh karena itu, secara umum direkomendasikan untuk memperlakukan sampel RNA dengan DNase I untuk mencerna gDNA residu sebelum menantang aplikasi hilir (misalnya analisis ekspresi mRNA, analisis transkriptom, dll.). Langkah mencerna gDNA dapat dilakukan selama ekstraksi RNA, setelah ekstraksi RNA, atau sebelum transkripsi balik RNA.Berdasarkan positioning produk, produk yang disediakan oleh Yeasen adalah sebagai berikut:

Tabel 1: Daftar produk yang berhubungan dengan penghapusan DNA ekstraksi RNA atau sebelum transkripsi balik

3. DNase I untuk transkripsi in vitro untuk menghilangkan DNA template

Transkripsi in vitro (IVT) terutama menggunakan DNA sebagai cetakan, ditambah substrat dan penyangga yang sesuai untuk memperoleh RNA melalui transkripsi in vitro. Dalam percobaan transkripsi in vitro, RNA polimerase seperti T7, T3, dan SP6 umumnya digunakan untuk sintesis RNA. RNA yang disintesis mungkin memiliki residu DNA. Menghilangkan residu DNA bermanfaat bagi pengembangan percobaan hilir. Misalnya, dalam tahap pengembangan vaksin mRNA, penghilangan residu merupakan langkah penting, yang dapat mengurangi kesulitan pemurnian hilir dan meningkatkan kemurnian produk. Cetakan DNA biasanya dihilangkan menggunakan Recombinant DNase I (bebas RNase).Berdasarkan proses sintesis mRNA, produk yang dihasilkan oleh Yeasen adalah sebagai berikut: