Dengan pesatnya perkembangan glikoproteomik dan penelitian obat antibodi, modifikasi glikosilasi juga telah menarik banyak perhatian. Kontak antara sel dan sel, dan antara sel dan patogen terutama diselesaikan melalui interaksi gula dan protein, dan glikosilasi menentukan sifat adhesi glikokonjugat. Pada IgG, glikosilasi terkait-N yang dilestarikan pada Asn297 di wilayah Fc juga penting untuk aktivitasnya. Selain itu, beberapa antibodi juga memiliki N-glikana tambahan, yang, bersama dengan situs yang dilestarikan pada Asn297 di wilayah Fc, memengaruhi pengenalan, waktu paruh, dan respons imun antibodi.
Glikosilasi protein adalah modifikasi pascatranslasi kompleks yang melibatkan penyambungan rantai glikana pada lokasi tertentu pada protein. Bergantung pada jenis rantai glikana, glikoprotein dibagi menjadi glikoprotein terkait-N, glikoprotein terkait-O, dll.; selain itu, glikosilasi protein juga dipengaruhi oleh jenis sel inang dan kondisi fermentasi (seperti media kultur, nilai pH, suhu, dll.). Oleh karena itu, glikoprotein biasanya memiliki heterogenitas dalam pola glikosilasi, termasuk lokasi glikosilasi, kadar glikosilasi, dan struktur spesifik rantai glikana, sehingga analisis rantai glikana dan karakterisasi struktural menjadi sangat menantang. Untuk memperoleh informasi struktural rantai glikana dalam jumlah maksimum, strategi utama analisis rantai glikana adalah melepaskan rantai glikana dari protein terlebih dahulu, kemudian melakukan analisis dan karakterisasi terperinci. Dalam strategi ini, metode deglikosilasi yang efisien, akurat, dan stabil sangat penting.
Metode enzimatik saat ini banyak digunakan untuk deglikosilasi.
Glikoprotein dapat diklasifikasikan menjadi glikopeptida berikatan N dan berikatan O berdasarkan jenis rantai glikananya. Untuk glikopeptida berikatan N, enzim yang umum digunakan meliputi peptida N-glikosidase F (PNGase F), endoglikosidase H (Endo H) dan endoglikosidase S (Endo S). PNGase F menghidrolisis ikatan GlcNAc-Asn dan dapat menghilangkan rantai glikana yang mengandung banyak manosa, kompleks, dan hibrida. Endo H memecah ikatan glikosidik dalam inti pentasakarida rantai N-glikana. Endo S secara khusus memecah glikana berikatan N dari inti kitobiosa rantai berat IgG asli.
Gambar 1. Situs pemotongan PNGase F, Endo H dan Endo S.
Diantaranya, PNGase F adalah metode enzimatik yang paling efektif untuk menghilangkan hampir semua N-linked oligosakarida dalam glikoprotein, yang dapat memecah glikoprotein oligosakarida kompleks, hibrida, dan bermanosa tinggi yang dihubungkan oleh asparagin, khususnya dengan menghilangkan glikana yang terikat N. Tempat pemecahannya adalah: ikatan amida antara N-asetilglukosamin (GlcNAc) terdalam dan residu asparagin, sekaligus mengubah asparagin pada protein setelah hidrolisis enzimatik menjadi asam aspartat.
Ketika α1-6 fucose terletak pada inti GlcNAc, PNGase F juga dapat memotong; hanya ketika α1-3 fucose terletak pada inti GlcNAc (umum pada glikoprotein tumbuhan dan serangga), PNGase F tidak dapat memotong.
Namun, reaksi enzimatik PNGase F konvensional memerlukan waktu beberapa jam untuk melepaskan antibodi N-glikan, dan karena preferensi untuk pelepasan glikan, deglikosilasi yang tidak lengkap dapat menyebabkan hasil yang bias, dan distribusi glikan yang diperoleh mungkin tidak mewakili komposisi antibodi terapeutik yang benar. Oleh karena itu, memperoleh profil N-glikan yang akurat secepat mungkin sangat penting untuk pemantauan glikosilasi selama proses produksi antibodi dan protein fusi antibodi serta agen bioterapi lainnya.
PNGase F Cepat
Fast PNGase F adalah reagen rekombinan yang dioptimalkan yang dapat dengan cepat dan tuntas mendeglikosilasi antibodi, imunoglobulin, protein fusi, dan glikoprotein lain dalam beberapa menit. Enzim ini dapat dengan cepat dan tanpa preferensi menghilangkan semua N-glikana dan dapat langsung digunakan untuk kromatografi hilir atau analisis spektrometri massa.
Fitur Produk:
Cepat: Deglikosilasi lengkap dan cepat dalam beberapa menit.
Kemurnian Tinggi: Tidak ada kontaminasi protease, glikosidase, kemurnian ≥95%.
Non-selektif: Singkirkan semua N-glikana dengan cepat dan tanpa preferensi.
Kompatibilitas Baik: Langsung digunakan untuk kromatografi hilir atau analisis spektrometri massa.
Data Uji:
Deglikosilasi protein satu langkah:
- Substrat 10 ug/antibodi 100 ug dan ddH2O dicampur hingga volume total 16 uL;
- Tambahkan 4 μL Fast PNGase F Buffer (5x), volume akhir 20 uL;
- Tambahkan 1 μL Fast PNGase F.
- Inkubasi pada suhu 50°C selama 10 menit.
Gambar 2. Efek pembelahan enzimatik satu langkah pada substrat protein (A) dan antibodi (B).
1: Protein MarkerCat#20350ES) 2: Pesaing + substrat atau antibodi 3: Pesaing + substrat atau antibodi 4:
Deglikosilasi protein dua langkah:
- Substrat 10 ug/antibodi 100 ug dan ddH2O dicampur hingga volume total 16 uL;
- Tambahkan 4 μL Fast PNGase F Buffer (5x), volume akhir 20 uL;
- Inkubasi pada suhu 80°C selama 2 menit, dinginkan hingga suhu ruangan.
- Tambahkan 1 μL Fast PNGase F.
- Inkubasi pada suhu 50°C selama 10 menit.
Gambar 3. Efek pembelahan enzimatik dua langkah pada substrat protein (A) dan antibodi (B).
1: Protein MarkerCat#20350ES) 2: Pesaing + substrat atau antibodi 3: Pesaing + substrat atau antibodi 4:
Kesimpulan:
-
Yeasen PNGase F cepat memiliki efisiensi pembelahan enzimatik yang sama atau lebih tinggi dengan pesaing yang diimpor dalam kondisi reaksi yang sama; - Disarankan untuk melakukan pembelahan enzimatik dua langkah untuk memastikan efisiensi pembelahan enzimatik yang lebih tinggi. Beberapa antibodi (seperti Fab N-glikosilasi) memerlukan langkah pemanasan awal
untuk deglikosilasi yang efisien.
Selain itu,
Panduan Pembelian
| Jumlah produk | 20406ES | 20407ES | 20414ES | 20413ES |
| Nama Produk | Cepat PNGase F | PNGase F | Endo H | Endo S |
| Sumber | Ekspresi rekombinan ragi | Ekspresi rekombinan ragi | Ekspresi rekombinan ragi | Bakteri E.coli ekspresi rekombinan |
| Aktivitas Spesifik | Tidak berlaku | 100000 U/ml | 1000000 U/ml | 8000 U/mg |
| Situs Pembelahan | Hampir semua glikana yang terhubung dengan N | Hampir semua glikana yang terhubung dengan N | Glikana mannosa tinggi yang terhubung dengan N | Membelah dalam struktur disakarida inti rantai berat IgG |
| Waktu Pencernaan | 10 menit | 1-3 jam | 1-3 jam | 1 jam |
| Glikosilasi | Sesuai | Sesuai | Sesuai | Sesuai |
| Struktur Protein | Sesuai | Sesuai | Sesuai | Sesuai |
informasi pemesanan
| Nama Produk | Nomor Produk | Spesifikasi |
| 20406ES20/50 | 20T/50T | |
| Nomor telepon 20407ES01/02 | 15000 unit/75000 unit | |
| Nomor 20414ES92/97 | 10000 unit/50000 unit | |
| 20413ES80/90 | 1000 U/5 x 1000 U |