Ketika berbicara tentang telomer dan Protelomerase Dalam biologi, pikiran orang-orang sering kali pertama kali berpikir tentang penuaan, sebuah fenomena alam yang tak terelakkan. Telomer adalah urutan DNA berulang pada ujung kromosom eukariotik, yang mengandung tanggung jawab menjaga integritas kromosom dan mengatur siklus pembelahan sel.
Protelomerase adalah enzim sintesis DNA transkriptase balik yang memperpanjang telomer. Ini adalah nukleoprotein yang terdiri dari RNA dan protein. Komponen protein dapat mengkatalisis sintesis urutan pengulangan telomer dengan komponen RNA.
Gambar 1. Mekanisme Perpanjangan Telomer yang Dimediasi Protelomerase[1]
Protelomerase dapat memperbaiki dan memperpanjang telomer, memperbaiki cacat pada replikasi DNA, mencegah hilangnya telomer selama pembelahan sel, dan meningkatkan jumlah pembelahan sel. Pada tahun 2009, Penghargaan Nobel dalam Fisiologi atau Kedokteran diberikan kepada Elizabeth H Blackburn, Carol W Greider, dan Jack W Szostak atas kontribusi luar biasa mereka dalam mengungkap peran penting telomer dan Protelomerase dalam fungsi seluler dan penuaan.
Hari ini, saya ingin memperkenalkan kepada Anda sebuah Protelomerase yang unik: TelN proProtelomerase. TelN Protelomerase berasal dari bakteriofag N15 dan merupakan komponen sistem replikasi N15, berpartisipasi dalam pembentukan DNA profag linier. Tidak seperti Protelomerase Pada eukariota, TelN merupakan enzim protein murni tanpa komponen RNA. Ia memiliki mekanisme pembelahan-ligasi. aktivitas dan meninggalkan ujung yang tertutup secara kovalen di lokasi pembelahan setelah memotong DNA untai ganda (dsDNA).
Gambar 2. Protelomerase TelN Situs Pembelahan
Protelomerase TelN Mekanisme Aksi
Situs pengenalan TelN Protelomerase adalah urutan palindrom yang panjangnya 56 bp, dengan telR dan telL di kedua sisinya. Posisi sentral dari urutan target juga merupakan urutan palindrom telO. TelN Protelomerase membelah dalam urutan telO dan membentuk struktur jepit rambut tertutup secara kovalen di kedua ujung pembelahan. Ujung DNA setelah pencernaan masih terdiri dari telR dan telL, yang dikenal sebagai tulang anjing DNA (dbDNA).
Gambar 3. Protelomerase mekanisme pembelahan di situs TelN[2]
Berkat aktivitas enzim pembelahan-ligasi khusus dari TelN Protelomerase, DNA plasmid sirkuler dapat diubah menjadi molekul berbentuk halter yang tertutup secara kovalen linier melalui reaksi enzimatik satu langkah. Dibandingkan dengan molekul DNA terbuka linier, DNA tertutup linier memiliki tingkat ekspresi protein yang lebih tinggi dalam sel, yang sangat cocok untuk membangun DNA mini ujung tertutup linier dengan stabilitas tinggi dan urutan asing minimal. DNA plasmid memainkan peran penting sebagai elemen inti vaksin mRNA, vaksin DNA, dan terapi gen sel. Metode produksi plasmid tradisional melibatkan fermentasi dengan Bakteri E.coli dan amplifikasi multi-tahap, dan risiko yang tidak terkendali dalam proses fermentasi membatasi hasil plasmid berkualitas tinggi, yang menjadi kunci untuk membatasi kapasitas produksi vaksin. Perusahaan Touchlight di Inggris telah meluncurkan teknologi dbDNA yang inovatif. Teknologi ini mengganggu metode tradisional fermentasi bakteri untuk persiapan DNA plasmid dan sebagai pengganti menggunakan sintesis enzimatik DNA in vitro. Aktivitas pembelahan-ligasi enzim khusus TelN Protelomerase juga digunakan untuk menghasilkan mini DNA linear tertutup dalam metode di atas.
Aplikasi TelN Protelomerase dalam Sintesis DNA Enzimatik
Metode enzimatik DNA in vitro berdasarkan DNA polimerase phi29 dan TelN Protelomerase dapat menghindari banyak risiko yang tidak dapat dikendalikan dalam proses fermentasi biologis, dan metode enzimatik in vitro dapat mensintesis DNA dengan kecepatan tinggi dan hasil yang tinggi. DNA yang disintesis dapat digunakan dalam banyak teknologi baru, seperti vaksin mRNA, vaksin DNA, vektor terapi gen, dan penyuntingan gen.
Gambar 4. Diagram Alir Sintesis DNA Enzimatik[3]
Proses Sintesis DNA Enzimatik
- Denaturasi templat
Cetakan DNA plasmid sirkular diubah menjadi dua DNA sirkular beruntai tunggal melalui proses denaturasi.
- Amplifikasi lingkaran bergulir
Amplifikasi lingkaran bergulir dilakukan dengan menggunakan DNA polimerase Phi29 dan DNA melingkar beruntai tunggal untuk menghasilkan DNA konkaterik beruntai ganda linier panjang dengan interval urutan pengenalan Protelomerase.
- Pemotongan dan Penutupan Kovalen
TelN Protelomerase mengenali telRL pada DNA kompleks telomerik, dan melakukan aktivitas pembelahan-ligasi untuk menghasilkan monomer DNA linear yang terhubung secara kovalen.
- Penghapusan DNA tulang punggung bakteri
Enzim endonuklease restriksi atau eksonuklease mendegradasi DNA kerangka bakteri dengan struktur terbuka di ujungnya untuk memperoleh DNA yang hanya mengandung elemen ekspresi gen target. Teknologi sintesis DNA enzimatik melewati fermentasi biologis dan dapat dengan cepat mencapai sintesis DNA plasmid tingkat GMP, sehingga memecahkan keterbatasan kapasitas produksi di bidang terapi gen dan vaksin mRNA. Teknologi ini memiliki potensi yang sangat besar untuk industrialisasi. Untuk mendorong pengembangan teknologi sintesis DNA enzimatik,
Ppresentasi kinerja dari
- Kinerja ligasi-belahan sangat baik, setara dengan merek impor.
Menggunakan plasmid superkoil yang mengandung situs pengenalan Protelomerase TelN sebagai templat, enzim penambahan gradien (0,078-5 U) dari
Gambar 5. Deteksi aktivitas pembelahan protelomerase dari TelN M:Marker, C: kontrol plasmid superkoil
- Integritas penutupan dsDNA linier > 90%
Menggunakan plasmid superkoil yang mengandung situs pengenalan TelN Protelomerase sebagai templat, menambahkan TelN Protelomerase
Gambar 6. Uji integritas penutupan ujung TelN Protelomerase. C1: plasmid yang mengandung situs pengenalan TelN, tanpa TelN Protelomerase; C2: plasmid yang mengandung situs pengenalan TelN, TelN Protelomerase, tanpa eksonuklease T5; Plasmid: plasmid yang mengandung situs pengenalan TelN.
Produk Terkait dari Sintesis DNA Enzimatik
| Klasifikasi Produk | Nama Produk | Nomor Katalog. |
| Protelomerase | 14540ES | |
| DNA Polimerase Phi29 | 14404ES | |
| Eksonuklease | Eksonuklease III | 14525ES |
| 14538ES | ||
| dNTP | 10125ES |
Rreferensi
[1] Giardini MA, Segatto M, da Silva MS, Nunes VS, Cano MI. Telomer dan Protelomerase biologi. Prog Mol Biol Transl Sci. 2014;125:1-40.
[2] Heinrich J, Schultz J, Bosse M, Ziegelin G, Lanka E, Moelling K. Mini DNA linier tertutup yang dihasilkan oleh enzim pembelahan-penggabungan prokariotik TelN berfungsi dalam sel mamalia. J Mol Med (Berl). 2002;80(10):648-654.
[3] Heinrich J, Schultz J, Bosse M, Ziegelin G, Lanka E, Moelling K. Mini DNA linier tertutup yang dihasilkan oleh enzim pembelahan-penggabungan prokariotik TelN berfungsi dalam sel mamalia. J Mol Med (Berl). 2002;80(10):648-654. doi:10.1007/s00109-002-0362-2.