- Latar belakang
Data yang dirangkum dalam laporan ini dilakukan oleh
Data ringkasan hanya untuk referensi pengguna, dan pengguna perlu memverifikasi metode mikoplasma dengan menggunakan sampel mereka sendiri untuk memastikan metode tersebut dapat memenuhi persyaratan pengguna. Semua laboratorium yang menggunakan kit ini disarankan untuk memverifikasi parameter berikut: Batas deteksi, Spesifisitas, dan Ketahanan.
Konten Validasi：
| Pertunjukan | Parameter Validasi | Hasil Validasi |
| Batas Deteksi | Batas Deteksi Strain Mycoplasma | Batas deteksi untuk 10 jenis mikoplasma farmakope: 10 CFU/mL, masing-masing diuji 24 kali dengan tingkat deteksi ≥95%. |
| Kekhususan | Contoh Interferensi Matriks | Menguji 9 matriks sampel dan larutan pengenceran DNA yang berbeda, tidak terdeteksi mikoplasma. |
| Reaksi silang | Menguji 14 strain dan 6 sel rekayasa yang umum digunakan dalam biofarmasi, tidak ada mikoplasma yang terdeteksi. | |
| Daya tahan | Stabilitas Beku-Cair | Dapat menahan 20 siklus beku-cair berulang tanpa mempengaruhi kinerja kit. |
| Stabilitas Akselerasi Termal | Tidak terpengaruh dalam kondisi 37°C selama 14 hari dan 4°C selama 30 hari. | |
| Kompatibilitas Instrumen | Kompatibel dengan ABI7500, ABI QuantStudio™5, Bio-Rad CFX96, dan Roche LightCycler®480. | |
| Cakupan | Cakupan Jenis DNA Mikoplasma | Perbandingan basis data menggunakan urutan 16S rRNA mikoplasma mencakup 183 spesies dalam kelas Mollicutes. |
- Bahan dan metode percobaan
2.1 MycPergiWaktu Standar Kit Deteksi qPCR Real-time Mycoplasma (2G), Penjual:
2.2 Mol MurniWaktu Standar Kit Persiapan Sampel DNA Residu Magnetik, Vendor:
2.3 Standar sensitivitas Mycoplasma dibeli dari Minerva Biolabs (MB), yang galurnya berasal dari National Collection of Type Cultures (NCTC). Standar sensitivitas tersebut adalah mikoplasma yang diinaktivasi dan digunakan untuk verifikasi metodologis metode amplifikasi asam nukleat (metode qPCR/PCR) untuk deteksi mikoplasma. Sebanyak 10 jenis mikoplasma dibeli yang mencakup persyaratan EP 2.6.7 dan JP G3. Informasi standarnya adalah sebagai berikut:
| Penjual | Kucing No. | Nomor NCTC. | ATCC TIDAK. | Nama Material |
| Laboratorium Bio Minerva (MB) | 102-1003 | tahun 10129 | 23838 | 10CFU™ Standar Sensitivitas Mycoplasma arginina |
| 102-2003 | tahun 10112 | 23714 | 10CFU™ Standar Sensitivitas Mycoplasma orale | |
| Nomor telepon 102-3003 | tahun 10115 | tahun 19610 | 10CFU™ Standar Sensitivitas Mycoplasma gallisepticum | |
| Nomor telepon 102-4003 | tahun 10119 | 15531 | 10CFU™ Standar Sensitivitas Mycoplasma pneumoniae | |
| Nomor telepon 102-5003 | tahun 10124 | 25204 | 10CFU™ Standar Sensitivitas Mycoplasma sinovial | |
| Nomor telepon 102-6003 | tahun 10117 | tahun 19989 | 10CFU™ Standar Sensitivitas Bakteri mikoplasma fermentans | |
| Nomor telepon 102-7003 | tahun 10130 | 17981 | 10CFU™ Standar Sensitivitas Mycoplasma hyorhinis | |
| Telepon 102-8003 | tahun 10116 | 23206 | 10CFU™ Standar Sensitivitas Acholeplasma laylawii | |
| Nomor telepon 102-9003 | tahun 10164 | 27556 | 10CFU™ Standar Sensitivitas Spiroplasma citri | |
| Nomor telepon 102-11003 | 10113 | 23064 | 10CFU™ Standar Sensitivitas Mycoplasma salivarium |
2.4 Data asli: versi elektronik dicatat dalam 'Laporan Eksperimen' subfile dari file induk 'MycAwayWaktu Standar Kit Deteksi qPCR Real-time Mycoplasma (2G)'.
2.5 Metode: Bahan dan metode operasi yang digunakan untuk percobaan pada dasarnya diproduksi atau ditetapkan oleh
- Isi dan hasil kualifikasi
3.1 Batas Deteksi (LOD)
Ekstraksi asam nukleat serta deteksi galur standar Mycoplasma 10 CFU/mL dilakukan sesuai dengan petunjuk untuk galur standar serta petunjuk untuk kit ekstraksi dan deteksi. Sebanyak 24 pengujian diperoleh untuk galur standar Mycoplasma 10 CFU/mL. Sampel NCS (Negative Control Sample) dan NTC (No Template Control) diuji secara bersamaan dalam setiap percobaan.
Hasilnya menunjukkan bahwa hasil NCS dan NTC memuaskan, dan seluruh 24 sampel 10 CFU/mL dinyatakan positif, memenuhi persyaratan memiliki setidaknya 23 hasil positif dari 24 pengujian.
| TIDAK. | Nama Material | Konsentrasi cairan bakteri |
| 1 | Mycoplasma arginina | 10 CFU/ml |
| 2 | Mycoplasma orale | 10 CFU/ml |
| 3 | Mycoplasma gallisepticum | 10 CFU/ml |
| 4 | Mycoplasma pneumoniae | 10 CFU/ml |
| 5 | Mycoplasma sinovial | 10 CFU/ml |
| 6 | Bakteri mikoplasma fermentans | 10 CFU/ml |
| 7 | Mycoplasma hyorhinis | 10 CFU/ml |
| 8 | Akoloplasma laylawii | 10 CFU/ml |
| 9 | Spiroplasma citri | 10 CFU/ml |
| 10 | Mycoplasma salivarium | 10 CFU/ml |
Tabel 1 Informasi tentang strain yang tervalidasi
| 10 CFU/ml | Percobaan 1 | Percobaan 2 | Percobaan 3 |
| Tingkat Deteksi | 8/8 | 8/8 | 8/8 |
| Total | 24/24 | ||
Tabel 2 Hasil batas deteksi
3.2 Spesifisitas
3.2.1 Kisaran uji mikoplasma
Urutan probe primer dalam kit dibandingkan dengan genom 16S rRNA dalam database. Melalui analisis bioinformatika, diperoleh bahwa MycAwayWaktu Standar Kit Deteksi qPCR Mycoplasma (Metode Probe) dari NextSense Biologicals dapat mencakup setidaknya 183 spesies Zooxanthellae, termasuk 120 Mycoplasma, 9 Ureaplasma, 33 Spiroplasma, dan 7 Cholestrongyla, dan seterusnya.
3.2.2 Contoh Interferensi Matriks
9 substrat (Dulbecco's MEM, Ham's F-10 Medium, M-199 Medium, Ham's F-12K Kaighn's, RPMI-1640 Medium, McCoy's 5A, Ham's F-12K Kaighn's + 1,0 mM/L Glutamin, L-15 LEIBOVITZ MEDTA +2.05 mM L-Glutamin, DMEM-Media Standar Glukosa Rendah) digunakan sebagai sampel untuk memverifikasi gangguan matriks sampel, hasil menunjukkan bahwa media tidak memiliki gangguan pada reagen kit.
3.2.3 Jangkauan deteksi Flexibacteria
Ekstraksi dan deteksi mikoplasma yang tidak aktif (Mycoplasma arginini, Mycoplasma orale, Mycoplasma gallisepticum, Mycoplasma pneumoniae, Mycoplasma synoviae, Mycoplasma fermentans, Mycoplasma hyorhinis, Acholeplasma laidlawii, Spiroplasma citri, Mycoplasma salivarium) pada 10 CFU/mL diperlukan bersama dengan pengujian sampel NCS dan NTC.
Hasil penelitian menunjukkan bahwa NCS dan NTC tidak terdeteksi dan hasilnya negatif; semua 10 spesies mikoplasma terdeteksi dan hasilnya positif.
3.2.4 Reaksi silang
Untuk 14 strain non-flexibacterial termasuk Clostridium (Clostridium perfringens, Clostridium acetobutylicum), Lactobacillus (Lactobacillus acidophilus), Streptococcus (Streptococcus mutans, Streptococcus pneumoniae), sejumlah mikroorganisme bacillus-coccus-fungi umum lainnya (Staphylococcus epidermidis, Acinetobacter baumannii, Enterobacter aerogenes, Micrococcus garciniae, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonalbacterium leucocephala, Salmonella enterica enteritidis subsp. enterica, Bacillus subtilis, Bacillus subtilis, dan Bacillus sp. Bacillus cereus, Bacillus cereus), dan enam sel rekayasa (HEK293, 293T, Vero, CHO, E.coli, SF9) digunakan untuk deteksi mikoplasma menggunakan MolPureWaktu Standar Metode Manik Magnetik untuk Kit Praproses Sampel DNA Residu (botol) dan MycAwayWaktu Standar Kit Deteksi Mycoplasma qPCR (Metode Probe) (2G), dan setiap percobaan dilakukan bersamaan dengan pengujian sampel PCS, NCS, dan NTC.
Hasil penelitian menunjukkan bahwa hasil PCS, NCS, dan NTC memuaskan; sampel uji negatif dan tidak terjadi reaksi silang.
3.3 Ketahanan
3.3.1 Stabilitas beku-cair
Peralatan uji Mycoplasma telah melalui percobaan pembekuan-pencairan pada suhu -25℃~-15℃, dan hasilnya menunjukkan bahwa peralatan tersebut mampu bertahan terhadap pembekuan dan pencairan berulang sebanyak 20 kali, dan tidak mengalami perubahan pada kinerjanya.
3.3.2 Stabilitas yang Dipercepat
Kit deteksi Mycoplasma dipercepat panasnya pada suhu 37℃ selama 14 hari dan pada suhu 4℃ selama 30 hari, dan hasilnya menunjukkan bahwa kinerja produk tidak terpengaruh.
3.3.3 Penerapan instrumen
Untuk kit deteksi mikoplasma, berbagai konsentrasi kontrol positif dan DNA Mycoplasma pneumoniae dalam kit digunakan sebagai sampel yang akan diuji, dan percobaan dilakukan pada empat merek dan model berbeda, yaitu, Thermo Scientific ABI7500, Thermo Scientific ABI Q5, Shanghai Hongshi SLAN-96S, dan Roche LightCycler®480.Percobaan dilakukan pada instrumen qPCR dari empat merek dan model berbeda, Shanghai Hongshi SLAN-96S dan Roche LightCycler®480.
Hasil penelitian menunjukkan bahwa sampel yang akan diuji terdeteksi pada instrumen qPCR berbagai model produsen dan hasil kontrol negatif memenuhi syarat, dan kinerja kit tidak terpengaruh.
- 4.Referensi
4.1 Metode pemeriksaan Mycoplasma <3301>. Farmakope Tiongkok, Bagian III [S]. Beijing: China Science and Technology Press, 2020: 542-543.
4.2 Pedoman untuk validasi metode analisis <9101>. Farmakope Tiongkok, Bagian III [S]. Beijing: China Science and Technology Press, 2020: 682.
4.3 Pedoman untuk validasi metode alternatif untuk pengujian mikrobiologi obat-obatan <9201>. Farmakope Tiongkok, Bagian III [S]. Beijing: China Science and Technology Press, 2020: 684.
4.4 Mikoplasma. Farmakope Eropa[S]. Edisi ke-10, 2020: Bagian 2.6.7, 194-199.
4.5 Pengujian Mikoplasma untuk Substrat Sel yang Digunakan untuk Produksi Produk Bioteknologi/Biologi <G3-14-170>. Farmakope Jepang[S]. Edisi ke-18, 2021: 2678-2682.
4.6 Erica J. Fratz-Berilla, Phillip Angart, Ryan J.Graham, dkk. Dampak pada atribut kualitas produk antibodi monoklonal yang diproduksi dalam kultur bioreaktor sel CHO selama peristiwa kontaminasi mikoplasma yang disengaja. Bioteknologi dan Bioteknologi. 2020;117(9): 2802-2815.
4.7 Dmitriy V. Volokhov, Laurie J Graham, Kurt A Brorson, Vladimir E Chizhikov. Pengujian mikoplasma pada substrat sel dan biologik: Tinjauan teknik non-mikrobiologi alternatif. Mol Cell Probes. 2011 April-Jun;25(2-3):69-77.
4.8 AL Ingebritson, CP Gibbs, C. Tong, GB Srinivas. Metode deteksi PCR untuk menguji kontaminasi Mycoplasma pada vaksin hewan dan produk biologis. Lett in Applied Microbiology. 2015 Feb;60(2):174-180.
Informasi pemesanan
| Keterangan | Nomor Bagian |
| 18461ES | |
| Kit Deteksi qPCR MycAway™ Mycoplasma (2G) | 40619ES |