dNTP merupakan singkatan dari patterned ribonucleotide triphosphate yang digunakan dalam PCR, yang mampu memperbanyak untai DNA yang sedang tumbuh. Dengan kata lain, dNTP dalam PCR berikatan dengan untai DNA komplementer melalui ikatan hidrogen, dan untai DNA yang sedang tumbuh tersebut diperluas dengan bantuan DNA polimerase Taq. Apa aplikasi spesifik dNTP dalam PCR? Apa saja sifat yang harus dimiliki oleh dNTP dengan kemurnian tinggi?

1. Apa itu dNTP?
2. Berapa konsentrasi dNTP dalam PCR?
3. Apa saja sifat-sifat yang dibutuhkan dari dNTP dengan kemurnian tinggi?
4. Produk terkait dan kinerja

1. Apa itu dNTP?

Deoksinukleosida trifosfat (dNTP) adalah nukleosida trifosfat yang mengandung deoksiribosa, rantai nukleotida yang terdiri dari ribosa, basa, dan fosfat. dNTP adalah blok penyusun penting molekul asam nukleat, dan karenanya merupakan komponen penting campuran PCR karena tidak ada DNA teramplifikasi baru yang dapat dihasilkan tanpanya. Keempat deoksinukleotida individual yang menyusun sekuens DNA meliputi deoksiadenosin trifosfat (dATP), deoksitimidin trifosfat (dTTP), deoksisitidin trifosfat (dCTP), dan deoksiguanosin trifosfat (dGTP). Selain itu, kualitas dNTP juga penting untuk keberhasilan berbagai prosedur seperti PCR, sintesis cDNA, qPCR, sekuensing, kloning, dan pelabelan DNA.

Ada empat jenis dNTP, atau deoksinukleotida trifosfat, yang masing-masing menggunakan basa DNA yang berbeda: adenina (dATP), sitosin (dCTP), guanin (dGTP), dan timin (dTTP). Penggunaan dNTP selama fase ekstensi menyediakan basa tunggal yang siap masuk ke DNA dan menggandakannya, seperti bahan penyusun. Karena tujuan teknik ini adalah untuk mensintesis DNA baru, dNTP menyediakan nukleotida ke untai yang "terbuka" menggunakan cetakan dari satu sisi. Ini mengubah satu untai DNA menjadi dua, dan dapat berlanjut secara eksponensial selama reagen tetap ada hingga tahap penahanan akhir.

2. Berapa konsentrasi dNTP dalam PCR?

PCR merupakan teknik sintesis DNA in vitro yang dilakukan untuk menghasilkan beberapa salinan fragmen DNA yang diinginkan sehingga dapat divisualisasikan dengan elektroforesis gel. Tujuan PCR adalah untuk membuat sejumlah besar salinan DNA untuk berbagai aplikasi hilir dalam sekuensing DNA atau DNA mikrolarik. Komponen-komponennya meliputi cetakan DNA, primer, buffer, dan DNA polimerase Taq dNTP. Untuk memahami mekanisme PCR, perlu dipahami pentingnya dan prinsip komponen yang digunakan. dNTP merupakan salah satu komponen utama PCR. Fungsi dNTP dalam PCR adalah untuk mengamplifikasi untai DNA yang sedang tumbuh dengan bantuan DNA polimerase Taq dan untuk bergabung dengan untai DNA komplementer melalui ikatan hidrogen.

Proses PCR dibagi menjadi tiga langkah yang bergantung pada suhu: denaturasi, annealing, dan ekstensi. Selama langkah denaturasi, DNA untai ganda didenaturasi menjadi DNA untai tunggal. Selama langkah annealing, primer mengikat pada lokasi yang tepat dari urutan komplementernya, dan selama langkah ekstensi, DNA polimerase Taq menambahkan dNTP ke untai DNA yang sedang tumbuh. Setelah untai dibuka dan primer mengikat DNA untai tunggal, DNA polimerase Taq memulai aktivitas katalitiknya. Pada langkah berikutnya, penambahan dNTP dimulai, yang mengikat kompleks P-DNA dengan afinitas yang lebih rendah jika nukleotida komplementer yang tepat ada. Segera setelah DNA polimerase Taq bertahan, interaksi ikatan hidrogen antara basa komplementer dan dNTP terjadi. Di sini bukan seluruh nukleotida di awal, tetapi basa (basa nitrogen) pada dNTP yang memutuskan apakah akan mengikat atau tidak.Pertama, jika menemukan basa komplementer (A untuk T, G untuk C) pada cetakan ssDNA, maka akan terbentuk ikatan hidrogen di antara keduanya. Tiga ikatan hidrogen antara C dan G dan dua ikatan hidrogen antara A dan T terbentuk. Setelah ikatan hidrogen terbentuk, DNA polimerase Taq mematuhi penggabungan dNTP ke dalam untai DNA yang sedang tumbuh dengan membentuk ikatan fosfodiester. Sekarang setelah ikatan fosfodiester terbentuk, DNA polimerase Taq melangkah lebih jauh dalam menambahkan dNTP baru. Ikatan fosfodiester terbentuk antara 3'OH dari primer dan 5'P dari dNTP. Setelah ikatan hidrogen, DNA polimerase Taq mengkatalisis reaksi dengan menghilangkan gamma dan beta-fosfat dari trifosfat dNTP. Setelah reaksi selesai, dua pirofosfat (PPi) dilepaskan. Namun, kinetika pasti interaksi dNTP dan polimerase Taq dalam reaksi PCR masih belum diketahui.

Keempat nukleotida ini biasanya ditambahkan ke reaksi PCR dalam jumlah yang sama untuk penggabungan basa yang optimal. Namun, dalam situasi tertentu seperti mutagenesis acak oleh PCR, konsentrasi dNTP yang tidak seimbang sengaja diberikan untuk mendorong tingkat kesalahan penggabungan yang lebih tinggi oleh DNA polimerase yang tidak melakukan proofreading. Faktor yang menentukan konsentrasi dNTP minimum adalah panjang DNA dan komposisi urutan target. Dalam reaksi PCR, dNTP umumnya 50-200 μmol/L. Ketika konsentrasi dNTP akhir lebih besar dari 50 mmol/L, hal itu dapat menghambat aktivitas DNA polimerase Taq. Konsentrasi keempat dNTP harus sama untuk mengurangi kesalahan penggabungan selama amplifikasi karena kekurangan satu dNTP.

Dalam aplikasi PCR umum, konsentrasi akhir yang direkomendasikan untuk setiap dNTP biasanya 0,2 mM. Konsentrasi yang lebih tinggi mungkin berguna dalam beberapa kasus, terutama jika terdapat konsentrasi Mg yang tinggi.²⁺, sebagai Mg²⁺ mengikat dNTP dan mengurangi laju penggabungannya, meningkatkan laju non-spesifik. dNTP mengandung fosfat, yang dapat bergabung dengan Mg²⁺ untuk mengurangi konsentrasi Mg bebas²⁺, sehingga perubahan konsentrasinya akan mempengaruhi konsentrasi efektif Mg²⁺Dalam kondisi konsentrasi DNA dan dNTP yang tinggi, Mg²⁺ Konsentrasi harus disesuaikan. Selain itu, kelangkaan dNTP menyebabkan produk PCR tidak lengkap. Namun, dNTP yang melebihi konsentrasi optimal dapat menghambat PCR. Untuk penggabungan yang efisien oleh DNA polimerase, dNTP bebas harus ada dalam reaksi pada konsentrasi tidak kurang dari 0,01-0,015 mM.

3. Apa saja sifat-sifat yang dibutuhkan dari dNTP dengan kemurnian tinggi?

Sejak ditemukan, reaksi berantai polimerase merupakan alat yang tak tertandingi yang digunakan dalam penelitian genetika molekuler. dNTP digunakan dalam PCR untuk memperluas untai DNA yang sedang tumbuh. Bahkan jika kualitas dNTP dalam sistem tersebut buruk, hal itu akan berdampak negatif pada sifat produk akhir. YeasendNTP dengan kemurnian tinggi cocok untuk semua jenis aplikasi sintesis DNA yang sangat sensitif dan dapat direproduksi.

Yeasen menawarkan nukleotida, set, dan campuran bermutu GMP siap pakai, yang dipasok sebagai garam natrium dalam air murni pada pH 7,0. Proses pembuatannya menghilangkan kotoran dan inhibitor khusus PCR, dan dNTP diproduksi secara khusus untuk aplikasi biologi molekuler. dNTP dimurnikan dengan HPLC preparatif dan memiliki kemurnian setidaknya 99%. Mereka dapat digunakan dalam proses PCR, RT-qPCR, LAMP, pelabelan DNA, dan pengurutan DNA.
Standar kontrol yang ketat dan teknologi canggih memastikan kualitas produk terbaik. Setiap lot dNTP diuji untuk berbagai residu (DNA bakteri, DNA manusia, DNase, RNase, Endonuclease).Produk ini stabil dari satu batch ke batch lainnya dan cocok untuk semua jenis aplikasi sintesis DNA yang sangat sensitif dan dapat direproduksi.

4. Produk terkait dan kinerja

4.1 Tidak Ada Residu DNA Bakteri

Gambar 1. Hasil deteksi menunjukkan bahwa dNTP tidak memiliki residu genom bakteri.

4.2 Tidak ada residu DNA manusia

Gambar 2. Hasil deteksi menunjukkan bahwa dNTP tidak memiliki residu genom manusia.

4.3 Tidak ada kontaminasi DNase, RNase, dan Endonuclease

Gambar 3. Hasil deteksi menunjukkan bahwa dNTP tidak memiliki DNase, RNase, dan Endonuclease.

4.4 Amplifikasi PCR (DNA 20 kb)

Gambar 4. Hasil amplifikasi PCR adalah produk yang diharapkan berukuran 20 kb.

4.5 Informasi produk

Produk yang disediakan oleh Yeasen adalah sebagai berikut.

Tabel 1.Informasi produk