Meskipun mencapai hasil yang baik selama pandemi dan menunjukkan potensi yang besar, teknologi mRNA masih memiliki beberapa keterbatasan, seperti waktu ekspresi yang singkat dan penerjemahan protein yang terbatas. Meskipun fitur-fitur ini dapat memberikan tingkat keamanan tertentu, fitur-fitur ini menjadi keterbatasan untuk terapi seperti penggantian protein. Hal ini memerlukan dosis berulang untuk mempertahankan tingkat ekspresi protein, yang menimbulkan risiko dan tantangan baru seperti imunogenisitas dan antibodi penetral.
Self-amplifying RNA (saRNA) dapat menghasilkan respons imun yang sama pada dosis yang ratusan atau bahkan ribuan kali lebih kecil daripada mRNA tradisional. Dosis yang lebih rendah berarti biaya produksi yang lebih rendah, dan suntikan yang lebih jarang dapat mengurangi potensi efek samping toksik dari mRNA dan vektor pengiriman. Saat ini, beberapa kandidat saRNA telah memasuki uji klinis di seluruh dunia. Perusahaan-perusahaan besar seperti BioNTech secara aktif mengembangkan jaringan teknologi saRNA.
Meskipun saRNA menawarkan keuntungan signifikan dari segi biaya dan keamanan, strukturnya yang unik menghadirkan tantangan produksi baru. Molekul saRNA, yang menggabungkan urutan pengkodean RNA polimerase dengan urutan protein target, jauh lebih besar (~10kb) dan lebih kompleks (mengandung lebih banyak struktur sekunder) daripada mRNA tradisional. Hal ini secara signifikan meningkatkan kesulitan reaksi transkripsi in vitro, mengurangi hasil dan kemurnian produksi saRNA. Oleh karena itu, produksi saRNA menuntut standar yang lebih tinggi dalam proses sintesis, pemisahan, dan pemurnian.
Kromatografi afinitas, metode yang digunakan untuk pemisahan dan pemurnian, memiliki masalah seperti hasil dan integritas produk target yang rendah. Menggabungkan beberapa metode pemurnian kromatografi (misalnya, menambahkan kromatografi selulosa, kromatografi fase balik hidrofobik) merepotkan, menimbulkan pengotor baru, memiliki tingkat pemulihan yang rendah, dan mahal. Selain itu, sistem reaksi IVT yang digunakan untuk produksi skala besar dioptimalkan dari sistem yang sesuai untuk mensintesis urutan asam nukleat 100nt, sehingga tidak cocok untuk saRNA, yang ukurannya melebihi 10kb. Hal ini memerlukan pengoptimalan sistem reaksi IVT yang ada. Saat ini, metode pemurnian mRNA konvensional tidak dapat memenuhi persyaratan kualitas cairan mentah industri. Oleh karena itu, ada kebutuhan mendesak untuk mengembangkan dan mengoptimalkan proses pemisahan dan pemurnian tingkat industri yang lengkap dan efisien untuk RNA yang mengamplifikasi sendiri.
Optimasi Produksi Industri dan Metode Pemurnian
Untuk mengembangkan sistem produksi industri untuk mRNA yang mengamplifikasi diri (saRNA), penting untuk terlebih dahulu mengoptimalkan jenis dan komponen ion penyangga dalam sistem kotranskripsi IVT dalam skala kecil. Ini juga melibatkan penyempurnaan rasio pencucian sampel dan penyangga kromatografi untuk proses pemurnian hilir. Kondisi yang dioptimalkan ini kemudian dapat ditingkatkan ke produksi skala besar untuk memverifikasi apakah sistem dapat secara efektif meningkatkan kapasitas produksi dan meningkatkan kualitas produk mentah.
Sistem Reaksi Penambahan Tutup Kotranskripsi
Dalam sistem reaksi penambahan tutup kotranskripsi, komponen penyangga T7 meliputi 400 mM HEPES, 20 mM spermidin, 100 mM DTT, dan garam Mg2+.
Penyangga T7 - Jenis Garam Ion Magnesium
Jenis garam ion magnesium yang digunakan memengaruhi hasil dan integritas produk saRNA target.
- Untuk sintesis kotranskripsi skala kecil mRNA 1mg, menggunakan Mg(OAc)2 sebagai garam Mg2+ menghasilkan hasil dan integritas terbaik, dengan nilai masing-masing 100,5µg dan 62,9%.
- Sebaliknya, penggunaan garam ion magnesium lainnya seperti MgCl2 dan MgSO4 mengurangi hasil sekitar 25-50% dan integritas sekitar 10%, sehingga menurunkan hasil dan integritas secara signifikan.
Penyangga T7 - Konsentrasi Ion Magnesium
Konsentrasi optimal ion magnesium asetat (30-50mM) meningkatkan hasil dan integritas saRNA target, dengan hasil terbaik pada 35mM.
- Pada konsentrasi ion magnesium asetat 30-50mM, hasil saRNA mencapai 88,5-100,5µg, dan integritasnya 58,6-62,9%, menunjukkan hasil yang baik.
- Pada konsentrasi 35mM, hasil dan integritas berada pada titik tertinggi, masing-masing mencapai 100,5µg dan 62,9%.
Penyangga T7 - Garam Ion Magnesium Dikombinasikan dengan Garam Lainnya
Menambahkan garam lain ke buffer T7 dapat meningkatkan hasil dan integritas produk target secara signifikan.
- Penyangga T7 dasar mencakup 400 mM HEPES, 20 mM spermidin, 100 mM DTT, dan garam Mg2+, menghasilkan hasil dan integritas masing-masing sebesar 100,5µg dan 62,9%.
- Penambahan garam kedua, NaOAc, selanjutnya meningkatkan hasil dan integritas: hasil meningkat sebesar 20-110µg, dan integritas meningkat sekitar 2-8%.
Penyangga T7 - Konsentrasi Garam Gabungan
Ketika komponen garam kedua NaOAc (Na+) berada pada konsentrasi 5-30mM, hasil dan integritas saRNA target meningkat secara signifikan, dengan konsentrasi terbaik pada 15mM.
- Pada konsentrasi Na+ 3-30mM, hasil saRNA mencapai 120-210µg, dan integritasnya 64,4-70,2%, menunjukkan hasil yang baik.
- Pada konsentrasi Na+ 15mM, hasil dan integritas berada pada titik tertinggi, masing-masing mencapai 210µg dan 70,2%.
Metode Pemurnian Tunggal
Selama produksi dan pemurnian saRNA skala kecil (<50mg), penggunaan metode pemurnian yang berbeda dapat secara signifikan mengurangi kandungan dsRNA dan residu protein, memastikan hasil yang tinggi, efisiensi pembatasan, dan integritas produk. Efektivitas metode pemurnian dari yang terbaik hingga yang terburuk adalah: kromatografi afinitas > presipitasi litium klorida > ultrafiltrasi, kromatografi selulosa.
-
Kromatografi Afinitas
Untuk produksi mRNA skala besar, kromatografi lebih disukai. Pilihannya meliputi kromatografi fase terbalik, pertukaran ion, hidrofobik, dan afinitas, masing-masing dengan kelebihan dan kekurangannya. Kromatografi afinitas, yang sering digunakan untuk menangkap mRNA poli(A), menawarkan solusi skalabilitas dan platform dengan tingkat pemulihan >90%.
Fitur struktural utama mRNA, tutup 5' dan ekor poli(A) 3', memfasilitasi pemurnian. Kromatografi afinitas, mirip dengan pemurnian manik magnetik, menggunakan manik-manik yang terhubung dT untuk menangkap mRNA ekor poli(A). Kondisi garam yang tinggi melindungi muatan negatif, memungkinkan pengikatan melalui ikatan hidrogen AT, dan mRNA dielusi pada pH netral sedang dan konduktivitas rendah.
Kromatografi afinitas untuk RNA melibatkan "pengikatan garam tinggi, elusi garam rendah." Komposisi penyangga, ukuran molekul, suhu, dan konsentrasi sampel memengaruhi proses secara signifikan. Pemilihan jenis dan konsentrasi garam yang optimal melalui eksperimen sangat penting untuk pemurnian yang efisien.
Pemurnian: Metode ini menghasilkan integritas produk tertinggi (80,3%), kandungan dsRNA terendah (0,01µg/mg), efisiensi pembatasan tertinggi (96,4%), dan residu protein paling sedikit (1,20µg/mg), dengan hasil 136µg dan tingkat pemulihan 65%, menjadikannya yang terbaik dalam hal kemurnian dan kualitas produk.
-
Metode Pemurnian Lainnya:
Presipitasi Litium Klorida
Prinsip pemurnian mRNA menggunakan LiCl adalah bahwa litium dapat mengurangi tolakan elektrostatik antara molekul pada pH tertentu, memungkinkan presipitasi RNA yang efisien.Endapan tersebut kemudian dipisahkan dengan sentrifugasi, dilarutkan untuk memperoleh sampel RNA murni. Presipitasi LiCl sederhana, cepat, efektif untuk mRNA dengan berbagai ukuran, dan menghasilkan produk dengan kemurnian tinggi. Namun, ion litium yang tersisa dapat menghambat mRNA. Disarankan untuk menggunakan presipitasi LiCl untuk larutan yang mengandung sedikitnya 400 µg/ml RNA guna memastikan efisiensi pemurnian. Metode ini menghasilkan hasil yang tinggi (210µg), tetapi integritas produk hanya 70,2%, sehingga mengurangi kualitas produk secara signifikan. Metode ini tidak cocok untuk produksi skala besar.
Metode Manik Magnetik：
Manik-manik magnetik adalah partikel kecil yang bergerak searah di bawah medan magnet, biasanya terdiri dari inti oksida besi dan lapisan luar. Pemurnian manik-manik magnetik adalah teknik biologi molekuler umum untuk memperkaya molekul mRNA dari campuran dengan cepat dan efisien. Manik-manik magnetik fungsional yang berbeda memiliki gugus fungsional permukaan yang berbeda (misalnya, hidroksil, karboksil, Oligo(dT), streptavidin) untuk memurnikan berbagai biomolekul.
Manik-manik magnetik yang terkarboksilasi dapat memurnikan asam nukleat secara efisien, dengan molekul mRNA yang terikat melalui interaksi elektrostatik dalam kondisi asam. Penyesuaian kondisi memungkinkan pengikatan dan pelepasan mRNA secara selektif. mRNA yang lebih panjang dengan gugus fosfat bermuatan negatif yang lebih terbuka mengikat lebih mudah ke manik-manik. Untuk mRNA yang lebih pendek, volume manik yang lebih besar mungkin diperlukan. Manik-manik magnetik yang digabungkan dengan oligo(dT), mirip dengan kromatografi afinitas, memanfaatkan pengikatan spesifik antara ekor poli(A) mRNA dan Oligo(dT) manik-manik.
Ultrafiltrasi
Metode ini menghasilkan integritas saRNA terendah, sekitar 8% lebih rendah daripada kromatografi afinitas, dengan residu protein tertinggi (4,58µg/mg).
Kromatografi Selulosa
Metode ini menghasilkan kandungan dsRNA rendah (0,009 µg/mg) dan tingkat penutupan tinggi (96,4%). Namun, residu protein sedikit lebih tinggi (5,30 µg/mg), dengan tingkat pemulihan hanya 57% dan hasil 120 µg, keduanya secara signifikan lebih rendah daripada yang dicapai dengan kromatografi afinitas (masing-masing sekitar 10% dan 16 µg).
Proses Pemurnian
Komponen Penyangga Kromatografi - Penambahan Agen Pereduksi
Penambahan agen pereduksi ke dalam buffer kromatografi selama pemurnian dapat secara signifikan meningkatkan integritas produk, tingkat pemulihan, dan efisiensi pembatasan, sekaligus mengurangi kadar residu protein dan dsRNA produk sampingan dibandingkan dengan tidak menambahkan agen pereduksi.
- Tanpa Agen Pereduksi:
- Hasil: 136µg
- Tingkat Pemulihan: 65%
- Integritas: 80,3%
- dsRNA: 0,01 µg/mg
- Efisiensi Pembatasan: 96,4%
- Residu Protein: 1,20µg/mg
- Kemurnian dan kualitas produk baik.
- Dengan Agen Pereduksi (TCPE, DTT, β-mercaptoethanol):
- Hasil meningkat sebesar 10-40µg
- Tingkat Pemulihan meningkat sebesar 5-18%
- Integritas meningkat sekitar 1-5%
- Efisiensi Pembatasan: 96,4%
- dsRNA: serendah 0,005µg/mg
- Residu Protein: serendah 0,20µg/mg
- Peningkatan signifikan dalam kemurnian dan kualitas produk.
Komponen Penyangga Kromatografi - Jenis-jenis Agen Pereduksi
Berbagai jenis agen pereduksi yang ditambahkan ke buffer kromatografi dapat lebih meningkatkan integritas produk, tingkat pemulihan, dan efisiensi capping, sekaligus mengurangi residu dsRNA dan protein. TCPE ditemukan sebagai agen pereduksi yang paling efektif.
- Dengan TCPE:
- Hasil: 175µg
- Tingkat Pemulihan: 83%
- Integritas: 85,2%
- dsRNA: 0,005 µg/mg
- Efisiensi Pembatasan: 96,4%
- Residu Protein: 0,20µg/mg
- Kemurnian dan kualitas produk yang unggul.
Komponen Penyangga Kromatografi - Konsentrasi Agen Pereduksi
Penambahan agen pereduksi pada konsentrasi 5-15mM dalam buffer kromatografi dapat secara signifikan meningkatkan integritas produk, tingkat pemulihan, dan efisiensi capping, sekaligus mengurangi residu dsRNA dan protein. Konsentrasi optimal adalah 10mM.
- Menambahkan 5-15mM TCPE:
- Hasil: 160-178µg
- Tingkat Pemulihan: 76-85%
- Integritas: sekitar 85%
- dsRNA: 0,002-0,005 µg/mg
- Efisiensi Pembatasan: 96,4%
- Residu Protein: 0,20-0,52µg/mg
- Kemurnian dan kualitas produk yang baik.
- Dengan TCPE 10mM:
- Hasil: 178µg
- Tingkat Pemulihan: 85%
- Integritas: 85,4%
- dsRNA: 0,002 µg/mg
- Efisiensi Pembatasan: 96,4%
- Residu Protein: 0,20µg/mg
- Kemurnian dan kualitas produk yang optimal.
Rasio Pencucian
Pengendalian rasio buffer kromatografi terhadap air injeksi dalam proses pencucian (10-25):(75-90) dapat secara signifikan meningkatkan integritas produk, tingkat pemulihan, dan efisiensi penutupan, sekaligus mengurangi residu dsRNA dan protein. Rasio optimal adalah 15:85.
- Rasio (10-25):(75-90):
- Hasil: 150-179µg
- Tingkat Pemulihan: 71-85%
- Integritas: 84-90%
- dsRNA: 0,002-0,006 µg/mg
- Efisiensi Pembatasan: 96,4%
- Residu Protein: sekitar 0,20µg/mg
- Kemurnian dan kualitas produk yang baik.
- Dengan Rasio 15:85:
- Hasil: 179µg
- Tingkat Pemulihan: 85%
- Integritas: 90,0%
- dsRNA: 0,002 µg/mg
- Efisiensi Pembatasan: 96,4%
- Residu Protein: 0,20µg/mg
- Kemurnian dan kualitas produk yang optimal.
Metode Pemurnian Gabungan
Menggunakan kombinasi metode pemurnian yang berbeda dapat mengurangi kadar dsRNA dan residu protein dalam produk, sehingga meningkatkan kualitas secara keseluruhan. Urutan metode pemurnian yang disukai adalah: kromatografi afinitas > ultrafiltrasi + kromatografi afinitas > kromatografi afinitas + kromatografi selulosa > kromatografi selulosa + ultrafiltrasi. Kromatografi afinitas saja memberikan hasil terbaik.
-
Kromatografi Afinitas Saja:
- Hasil: 179µg
- Tingkat Pemulihan: 85%
- Integritas: 90,0%
- dsRNA: 0,002 µg/mg
- Efisiensi Pembatasan: 96,4%
- Residu Protein: 0,20µg/mg
- Kemurnian dan kualitas produk tertinggi.
-
Ultrafiltrasi + Kromatografi Afinitas:
- Hasil: 170µg (9µg lebih sedikit daripada kromatografi afinitas saja)
- Tingkat Pemulihan: 81% (4% lebih rendah dari kromatografi afinitas saja)
- Integritas: 88,5%
- dsRNA: 0,0015µg/mg
- Residu Protein: 0,18µg/mg
- Sedikit pengurangan residu dsRNA dan protein dibandingkan dengan kromatografi afinitas saja, tetapi pengurangan signifikan dalam hasil dan tingkat pemulihan. Metode ini lebih rumit, menggandakan waktu pemurnian dan meningkatkan biaya.
-
Kromatografi Afinitas + Kromatografi Selulosa / Kromatografi Selulosa + Ultrafiltrasi:
- dsRNA: 0,005µg/mg lebih rendah dibandingkan metode tunggal
- Hasil: 60-100µg lebih sedikit
- Tingkat Pemulihan: 30-40% lebih rendah
- Peningkatan jumlah langkah mengakibatkan peningkatan biaya tenaga kerja dan material.
Produksi Skala Besar
Dalam produksi skala besar, menggunakan kromatografi afinitas, kromatografi afinitas yang dikombinasikan dengan kromatografi selulosa, atau ultrafiltrasi yang dikombinasikan dengan kromatografi afinitas, hasil mRNA yang mengamplifikasi diri meningkat secara signifikan hingga 140-185µg, dengan tingkat pemulihan 67-88%. Integritas produk adalah 93-94%, kandungan dsRNA dikontrol dalam 0,0018-0,0020µg/mg, efisiensi pembatasan mencapai 96,1-96,4%, dan residu protein dipertahankan dalam 0,04-0,05µg/mg. Hal ini menunjukkan skalabilitas dan efisiensi yang baik untuk produksi skala besar.
Referensi:
[8] Metode Produksi dan Pemisahan Industri Pemurnian Cairan Mentah mRNA yang Dapat Mengamplifikasi Sendiri dan Aplikasinya [P]. Paten: CN118048418A. 17 Mei 2024.
Informasi Pemesanan