Struktur Cap merupakan komponen penting dalam pengembangan vaksin dan terapi mRNA. Teknologi mRNA sintetis mengandalkan Cap1 untuk meningkatkan stabilitas, efisiensi translasi, dan mengurangi pengenalan imun bawaan mRNA oleh reseptor tol-like (TLR) dan sensor imun lainnya, sehingga meminimalkan aktivasi imun yang tidak diinginkan. Hal ini mencegah respons inflamasi yang tidak diinginkan, sehingga meningkatkan stabilitas dan efektivitas mRNA terapeutik dalam sel manusia.
Penemuan Awal dan Struktur Cap0
Pada pertengahan 1970-an, penelitian terhadap mRNA eukariotik menemukan struktur terminal 5' yang sekarang dikenal sebagai Cap0, di mana tutup N7-metilguanosin (m7G) melekat pada nukleotida pertama di ujung 5'. Modifikasi ini ditemukan dapat melindungi mRNA dari degradasi oleh eksonuklease, membantu ekspor nuklir, dan mendorong pengenalan ribosom untuk inisiasi translasi. Cap0 adalah struktur tutup pertama yang dikarakterisasi, dengan metilasinya terbatas pada tutup guanosin itu sendiri. Penemuan tutup 5' ini dan fungsinya menandai terobosan signifikan dalam memahami tutup mRNA eukariotik dan perannya dalam modifikasi mRNA.
Munculnya Cap1
Struktur Cap1, fitur penting mRNA eukariotik, memainkan peran penting dalam stabilitas mRNA, translasi, dan pengenalan imun. Struktur cap mRNA, yang terdiri dari N7-methylguanosine (m7G) yang dikaitkan dengan nukleotida pertama melalui ikatan trifosfat 5'-5', berevolusi dari studi awal tentang modifikasi pascatranskripsi mRNA eukariotik pada tahun 1970-an.
Struktur mRNA yang ditutup dengan ujung 5′.【1】 Investigasi lebih lanjut mengungkapkan bahwa pada sebagian besar mRNA eukariotik, nukleotida pertama setelah tutup (posisi +1) juga dimetilasi pada posisi 2'-O ribosa, suatu proses yang dikenal sebagai metilasi 2'-O. Penemuan ini, yang dikenal sebagai struktur Cap1 (m7GpppNm), menambahkan lapisan signifikansi fungsional lainnya pada modifikasi mRNA. Modifikasi Cap1 ditemukan dapat menyempurnakan stabilitas mRNA dan mencegah pengenalan imun oleh sistem imun bawaan, khususnya pada sel mamalia, yang membantu menghindari pengenalan oleh reseptor pengenalan pola seperti RIG-I, TLR, dan MDA5【2】. Hal ini penting untuk metabolisme mRNA dan kemajuan teknologi berbasis mRNA, termasuk vaksinasi mRNA dan aplikasi terapi gen.
Tantangan Teknis dalam Industri mRNA dan Solusi Saat Ini
Beberapa tantangan teknis masih ada dalam penerapan dan pengoptimalan vaksin mRNA secara luas, termasuk masalah dengan mRNA dosis tinggi, respons imun, stabilitas, dan pengiriman. Tantangan signifikan dalam industri mRNA adalah perlunya dosis mRNA yang tinggi untuk menghasilkan respons imun yang kuat. Hal ini disebabkan oleh beberapa faktor:
Degradasi Cepat: mRNA pada dasarnya tidak stabil dan rentan terhadap degradasi oleh enzim pemenggal kepala dan ribonuklease (RNase) yang hadir dalam sistem biologis.
Efisiensi Penerjemahan Terbatas: Efisiensi penerjemahan mRNA menjadi protein dapat bervariasi, memerlukan jumlah mRNA yang lebih tinggi untuk menghasilkan kadar antigen yang cukup untuk respons imun. Efisiensi penerjemahan terkait dengan afinitas Cap1 dan faktor inisiasi penerjemahan eIF4E.
Pembentukan kompleks inisiasi translasi dasar pada eukariota.【3】
Imunogenisitas dan Reaksi Imun yang Tidak Diinginkan: Kendala terbesar ketiga adalah respons imun bawaan yang dapat dipicu oleh mRNA itu sendiri, terutama untuk dsRNA atau mRNA yang tidak lengkap. Meskipun tingkat aktivasi imun tertentu diperlukan untuk merangsang sistem imun adaptif, aktivasi yang berlebihan dapat menyebabkan respons inflamasi, yang dapat mengurangi efektivitas vaksin atau menimbulkan efek samping.
Sejarah Teknologi Capping
-
Teknologi Penutupan Enzimatik: Penutupan enzimatik, yang diperkenalkan pada awal penelitian mRNA, melibatkan penggunaan enzim penutup seperti guanililtransferase dan metiltransferase untuk menambahkan penutup 5' alami pascatranskripsi. Metode ini memastikan ketepatan tinggi dan efisiensi penutup dalam penerjemahan mRNA, terutama untuk aplikasi terapeutik.
-
Analog Tutup Sintetis (1980-an hingga 2000-an): Para peneliti mengembangkan analog kap sintetis untuk sintesis mRNA yang dikap secara in vitro, yang membantu mempelajari fungsi mRNA dan ekspresi gen. Anti-Reverse Cap Analog (ARCA) adalah analog kap sintetis yang dirancang untuk mencegah penggabungan kap yang salah selama sintesis mRNA, sehingga meningkatkan efisiensi penerjemahan mRNA untuk vaksin dan terapi gen. Akan tetapi, efisiensi dan hasil capping ARCA rendah.
-
Teknologi Cap1 (2010-an): Metode pembatasan ko-transkripsi Cap1 yang menyederhanakan proses dengan memasukkan penutup secara langsung selama sintesis mRNA. Metode ini meningkatkan efisiensi dan menghasilkan persentase mRNA yang ditutup dengan benar yang tinggi, sehingga ideal untuk aplikasi terapeutik skala besar seperti vaksin mRNA.
Saat ini, teknologi pembatasan enzimatik sangat penting dalam pengembangan terapi berbasis mRNA, termasuk vaksin COVID-19, yang memastikan stabilitas dan efektivitas penerjemahan mRNA terapeutik.
Perbandingan Enzymatic Capping, Generasi Berikutnya LZCap Capping dan metode Capping generasi pertama (ARCA)
Mengembangkan Analog Tutup Generasi Berikutnya
Kami bertujuan untuk mengembangkan analog kap yang tahan terhadap enzim pemenggal kap, afinitas tinggi terhadap eIF4E untuk meningkatkan efisiensi penerjemahan, dan imunogenisitas yang lebih rendah. Kemajuan ini sangat penting untuk meningkatkan efektivitas terapi berbasis mRNA, termasuk pengobatan antikanker dan aplikasi terapi gen.
Merancang LZCap
Dalam merancang LZCap, kami terutama berfokus pada pembuatan analog kap dengan afinitas tinggi terhadap eIF4E. Enzim memiliki pengenalan substrat yang relatif "spesifik". Oleh karena itu, ketika merancang struktur kap yang baru, kami berusaha untuk mempertahankan kesamaan dengan struktur alami/yang dikenal sebanyak mungkin. Struktur alami memiliki ribosa 3' OH, yang dapat dimodifikasi (misalnya, metilasi). Berdasarkan pertimbangan ini, kami memilih untuk menambahkan karbon pada posisi 3' untuk kebaruan, diikuti oleh NH untuk meniru ikatan hidrogen OH, dan kemudian gugus asetil untuk mengurangi kebasaan NH dan meningkatkan kemampuan ikatan hidrogennya. Aktivitas LZCap lebih baik daripada kap alami yang termetilasi, mungkin karena peningkatan ikatan hidrogen. Dibandingkan dengan gugus metil dan metoksi, gugus asetil amino juga dapat meningkatkan interaksi van der Waals antara substrat (kap) dan faktor pemicu (enzim).
Stabilitas Kelompok Amino Asetil
Kelompok asetil amino sudah cukup stabil. Kelompok ini jauh lebih stabil daripada posisi 7-metilasi dan ikatan fosfodiester, yang merupakan bagian yang paling tidak stabil dari tutupnya.
Hasil dan Efisiensi Pembatasan LZCap
Dengan tutup LZCap AG(3'Acm), efisiensi tutup mRNA luciferase sekitar 97,59%, dan hingga 200 μg mRNA yang ditutup dapat diperoleh dengan 1 μg cetakan DNA dalam reaksi transkripsi in vitro (IVT) standar dengan RNA polimerase T7. Kemurnian mRNA hingga 99% setelah presipitasi LiCl sederhana. Efisiensi tutup dan hasil yang tinggi ini menjadikan LZCap pilihan yang menarik untuk berbagai aplikasi, termasuk produksi protein dan terapi gen.
Struktur Cap merupakan komponen penting dalam pengembangan vaksin dan terapi mRNA.Teknologi mRNA sintetis mengandalkan Cap1 untuk meningkatkan stabilitas, efisiensi translasi, dan mengurangi pengenalan imun bawaan mRNA oleh reseptor tol-like (TLR) dan sensor imun lainnya, sehingga meminimalkan aktivasi imun yang tidak diinginkan. Hal ini mencegah respons inflamasi yang tidak diinginkan, sehingga meningkatkan stabilitas dan efektivitas mRNA terapeutik dalam sel manusia.
| Produk | Topi AG (3'-HAISaya-7mG) | LZCap AG (3'Acm) | AG (tanpa batasan) |
| hasil mRNA (mg) | 164 | 173 | 200 |
Analisis MS terhadap efisiensi capping mRNA Luciferase LZCapped dengan metode berbasis RNAse H. Efisiensi capping sekitar 97,59%,
Bagaimana stabilitas mRNA terhadap enzim penyingkap?
mRNA dengan LZCap AG (3'Acm) dan LZCap AG M6 (3'Acm) menunjukkan resistensi yang lebih tinggi terhadap enzim decapping (NEB). Perlu dicatat bahwa CapM6 (3'-OMe-6mA-7mG) juga resisten terhadap enzim decapping, tetapi Cap AG biasa (3'-OMe-7mG) tidak menunjukkan resistensi.
Bagaimana afinitas pengikatan LZCap ke eIF4E?
Bagaimana dengan ekspresi protein mRNA yang ditutupi LZCap AG(3'Acm)?
Ekspresi mRNA luciferase yang dilapisi LZCap AG(3'Acm) secara signifikan lebih tinggi daripada mRNA yang dilapisi analog Cap1 (3'-OMe-7mG) pada berbagai lini sel* (3T3-L1，Hela，JAWs，HEK293T dan Huh7). Percobaan dengan 130 kali pengulangan menunjukkan ekspresi mRNA luciferase yang dilapisi LZCap AG(3'Acm) sekitar 1,5 kali lebih tinggi daripada mRNA yang dilapisi (3'-OMe-7mG) secara rata-rata. Hasil serupa diamati pada tikus. Tingkat ekspresi protein dapat sedikit bervariasi dengan urutan mRNA yang berbeda.
Apakah Anda memiliki lebih banyak data hewan?
Efisiensi ekspresi LZCap AG(3'Acm) atau LZCap AG(3'FMom) dibatasi
mRNA yang mengkode GLuc menunjukkan ekspresi in vivo yang lebih tinggi relatif terhadap mRNA yang dilapisi CapAG (3'-OMe-7mG) pada Monyet Cynomolgus dan Babi.
Bagaimana dengan imunogenisitas bawaan mRNA yang dilapisi LZCap AG?
mRNA yang dilapisi LZCapAG (3'Acm) menunjukkan imunogenisitas bawaan yang rendah. TLR8, TLR7, IL-1A dan B memainkan peran penting dalam respons imun yang diinduksi oleh RNA yang tidak dilapisi. Studi in vivo tentang analisis imunogenisitas mRNA LZCapped menunjukkan bahwa RNA yang tidak dilapisi menyebabkan perubahan signifikan dalam tingkat transkripsi faktor terkait imun pada tikus. Baik mRNA yang dilapisi LZCap maupun 3'-OMe-7mG menunjukkan tingkat transkripsi faktor imun yang lebih rendah pada tikus setelah injeksi tunggal yang distimulasi RNA.
Sudahkah Anda melakukan uji keamanan?
Ya, kami melakukan Uji Sitotoksisitas, Studi Penghambatan Polimerase Manusia dan Uji Ames.
- Tidak ada atau sedikit sitotoksisitas yang diamati untuk monomer nukleosida 3'-Acm-7mG（CC50＞10000nM）dalam sel 293T、Huh7、MRC5、THP1 dan U87MG.
- DNA polimerase manusia ( α ,β , sebuah dan Klenow) dan studi penghambatan aktivitas RNA polimerase mitokondria (hPOLRMT) menunjukkan bahwa 3'-Acm-7mG TP tidak menghambat DNA atau RNA polimerase manusia.
- Uji mutasi balik bakteri (Ames) mendeteksi perubahan genetik terkait, serta karsinogen genotoksis pada sebagian besar hewan pengerat dan manusia. Uji Ames menunjukkan 3'-Acm-7mG tidak memiliki genotoksisitas.
Apakah produk ini telah dipatenkan?
Ya, patennya sudah diberikan di AS.
Informasi pemesanan
| Nama Produk | Spesifikasi | Nomor Katalog. |
| LZCap AG(3'Acm)（ 100 juta) | 100μL, 1mL | 10684ES |
| LZCap AU (3'Acm)( 100 juta) | 100μL, 1mL | 10685ES |
| LZCap GG (3'Acm) 100 juta) | 100μL, 1mL | 10686ES |
| LZCap AG (3'Ma-Cy5)（ 25 juta) | 100μL, 1mL | 10688ES |
| LZCap AG(3'Ma-Cy7)( 25 juta) | 100μL, 1mL | 10689ES |
| LZCap (AG(3'Ma-Cy3) (25 mM) | 100μL, 1mL | 10687ES |
| LZCap (AG(3'Ma-Biotin) (25 mM) | 100μL, 1mL | Pertanyaan |
| LZCap (AG(3'Ma-Peg5-FAM) (25 mM) | 100μL, 1mL | Pertanyaan |
| LZCap (AG(3'Ma-C6-MANT) (25 mM) | 100μL, 1mL | SAYApenyelidikan |
| LZCap (AG(3'Acm) mRNA kunang-kunang (1μg/μL) | 100μL, 1mL | SAYApenyelidikan |
| LZCap (AG(3'Acm) eGFP mRNA (1μg/μL) | 100μL, 1mL | SAYApenyelidikan |
| LZCap (AG(3'Acm) eGFP saRNA (1μg/μL) | 100μL, 1mL | SAYApenyelidikan |
| LZCap (AG(3'Acm) RFP mRNA (1 μg/μL) | 100μL, 1mL | Pertanyaan |
| LZCap (AG(3'Acm) mRNA Cas9 (1μg/μL) | 100μL, 1mL | SAYApenyelidikan |
| LZCap (AG(3'Acm) Gluc mRNA (1μg/μL) | 100μL, 1mL | SAYApenyelidikan |
Referensi:
- Mekanisme molekuler pembatasan dan metilasi RNA virus corona, Virologica Sinica 31(1)
- Vaksin mRNA — era baru dalam vaksinologi. Nat. Pdt. Penemuan Obat. 17, 261–279 (2018).
- Inisiasi Translasi Diatur oleh Protein Pengikat RNA pada Mamalia: Modulasi Kompleks Inisiasi Translasi oleh Faktor-Faktor Trans-Acting, Sel Tahun 2021, 10(7), 1711