Kit Sintesis RNA Hasil Tinggi T7 mengoptimalkan sistem reaksi transkripsi. Kit ini dapat mensintesis RNA untai tunggal secara efisien dengan menggunakan RNA polimerase T7, DNA untai ganda linier dengan urutan promotor T7 sebagai cetakan, dan NTP sebagai substrat untuk mengendalikan urutan DNA di hilir promotor. Selama transkripsi, nukleotida yang dimodifikasi dapat ditambahkan ke substrat untuk menyiapkan biotin atau RNA berlabel pewarna.

1. Pengenalan Kit Sintesis RNA Hasil Tinggi T7
2. Prinsip-prinsip dalam tabung reaksi transkripsi
3. Keuntungan dari Yeasen Kit Sintesis RNA Hasil Tinggi T7
4. Kinerja produk
5. Cara menggunakan kit ini
6. Pertanyaan yang Sering Diajukan
7. Informasi Pemesanan

1. Pengenalan Kit Sintesis RNA Hasil Tinggi T7

Kit Sintesis RNA Hasil Tinggi T7 dapat mensintesis transkrip panjang dan transkrip pendek, dan RNA dapat diproduksi 100-200 μg dengan input templat DNA 1 μg. RNA yang disintesis dapat digunakan untuk berbagai aplikasi hilir, seperti penelitian struktur dan fungsi RNA, perlindungan RNase, hibridisasi probe, interferensi RNA, mikroinjeksi, dan dalam tabung reaksi terjemahan.

2. Prinsip-prinsip dalam tabung reaksi transkripsi

Gambar 1. Dalam tabung reaksi proses transkripsi

3. Keuntungan dari Yeasen Kit Sintesis RNA Hasil Tinggi T7

Hasil yang sangat tinggi—hingga 200 µg dalam 2 jam
Serbaguna—cocok untuk transkrip RNA 20nt-10000nt
Berbagai kegunaan—menghasilkan RNA yang tidak berlabel, berlabel, atau tertutup

4. Kinerja produk

Gambar 2. Perbandingan hasil IVT

Catatan: Semua reagen reaksi berasal dari Kit Sintesis RNA T7 (Yeasen#10623 atau perusahaan B*). Reaksi IVT menghasilkan Yeasen dan perusahaan B* ditunjukkan di atas.

Gambar 3. Kualitas produk transkripsi untuk panjang yang berbeda

Gambar 4. Tingkat ekspresi mRNA yang ditranskripsi dalam sel HEK-293

Catatan: mRNA ditutup dengan Enzim Penutup Vaccinia (Yeasen(Nomor 10614/10615)

5. Cara menggunakan kit ini

5.1 Reagen pencairan

Sentrifus campuran T7 RNA Polimerase sebentar dan taruh di atas es. Cairkan 10× Transcription Buffer dan ribonukleotida (ATP, CTP, GTP, UTP), campur dan sentrifus ke dasar tabung, taruh 10× Transcription Buffer pada suhu ruangan dan taruh empat jenis ribonukleotida di atas es.

5.2 Siapkan sistem reaksi transkripsi sesuai dengan tabel berikut

Tabel 1.Metode persiapan sistem reaksi transkripsi

Catatan:
a) Reaksi disiapkan pada suhu kamar. Karena 10× Transcription Buffer mengandung spermidine, konsentrasi spermidine yang terlalu tinggi pada suhu rendah akan menyebabkan presipitasi cetakan DNA.
b) Transkrip pendek (<100 nt), templat 2 µg dapat digunakan, waktu transkripsi ditingkatkan menjadi 4-8 jam.
c) Untuk transkrip panjang (>1000 nt), templat plasmid linierisasi direkomendasikan untuk digunakan untuk transkripsi.
d) Lakukan reaksi dalam mesin PCR dengan tutup panas terbuka untuk mencegah larutan reaksi menguap dalam waktu lama.
e) Produk reaksi mungkin memiliki endapan putih. Ini adalah magnesium pirofosfat yang terbentuk oleh ion pirofosfat dan magnesium bebas selama reaksi, yang tidak akan memengaruhi percobaan berikutnya. Anda dapat menambahkan EDTA untuk menghilangkannya. Jika Anda khawatir penambahan EDTA memengaruhi percobaan berikutnya, supernatan juga dapat diambil dengan sentrifugasi.
f) Reagen dan wadah harus bebas dari kontaminasi RNase.

5.3 Inkubasi pada suhu 37°C selama 2 jam

Campurkan larutan reaksi di atas, sentrifus sebentar ke dasar tabung, dan inkubasi pada suhu 37°C selama 2 jam. Jika panjang transkrip kurang dari 100 nt, tingkatkan waktu reaksi menjadi 4-8 jam.

5.4 Perawatan DNase I (opsional)

Setelah reaksi selesai, tambahkan 2 μL DNase I (bebas RNase) ke setiap tabung dan inkubasi pada suhu 37°C selama 15 menit untuk menghilangkan DNA cetakan.

6. Pertanyaan yang Sering Diajukan

6.1 Hasil reaksi IVT rendah

Kualitas pola sangat erat kaitannya dengan hasil. Jika hasil kelompok eksperimen secara signifikan lebih rendah daripada kelompok kontrol positif, kemungkinan penyebabnya adalah:
① Template mengandung komponen yang akan menghambat reaksi IVT.
② Ada yang salah dengan templat.

6.2 Saran

① Murnikan kembali templatnya.
② Konfirmasikan konsentrasi dan integritas templat.
③ Memperpanjang waktu reaksi.
④ Tingkatkan input template.
⑤Coba RNA polimerase lain dan promotor yang sesuai.

6.3 Hasil transkrip pendek rendah

Jika transkrip target lebih pendek dari 100 nt, perpanjang waktu reaksi menjadi 4-8 jam atau tingkatkan masukan templat menjadi 2ug dalam sistem reaksi 20 μL.

6.4 Ada transkrip yang lebih panjang dan tidak terduga

Jika hasil elektroforesis gel menunjukkan adanya transkrip yang lebih panjang dan tidak diharapkan, kemungkinan penyebabnya adalah:
① Template plasmid mungkin tidak sepenuhnya terlinearisasi.
②Templat memiliki ujung yang kohesif dengan tonjolan sepanjang 3'.
③Transkrip memiliki struktur sekunder yang tidak sepenuhnya terdenaturasi.

6.5 Saran

①Periksa apakah templat plasmid telah sepenuhnya dilinearisasi. Jika perlu, lakukan linearisasi plasmid lagi.
②Pilih enzim restriksi yang sesuai untuk melinearisasi templat plasmid dan hindari menghasilkan ujung kohesif dengan tonjolan 3'. Jika perlu, fragmen Klenow atau DNA polimerase T4 dapat digunakan untuk menghasilkan ujung tumpul.
③Gunakan gel terdenaturasi untuk mendeteksi transkrip.

6.6 Ada transkrip yang lebih pendek yang tidak diharapkan

Jika hasil elektroforesis gel menunjukkan adanya transkrip pendek yang tidak diharapkan, kemungkinan penyebabnya adalah:
①Ada urutan yang analog dengan urutan terminasi RNA polimerase T7 dalam templat.
②Konten GC templatnya tinggi.

6.7 Saran

①Turunkan suhu reaksi (misalnya 30℃), tetapi perlu diingat bahwa terkadang penurunan suhu reaksi akan mengurangi hasil.
②Coba RNA polimerase lain untuk mengkatalisis reaksi IVT.
③Jika kandungan GC pada templat tinggi, atur suhu reaksi IVT pada 42℃ atau tambahkan SSB ke dalam sistem reaksi IVT untuk meningkatkan hasil dan panjang transkrip.

6.8 Terjadi pengolesan transkrip selama elektroforesis gel

Jika terjadi pengolesan transkrip selama elektroforesis gel, kemungkinan penyebabnya adalah:
①Terjadi kontaminasi RNase selama operasi percobaan.
②Templat DNA terkontaminasi oleh RNase.

6.9 Saran

①Pastikan semua reagen diformulasikan dengan H2O bebas RNase. Gunakan ujung pipet bebas RNase dan tabung Eppendorf serta kenakan sarung tangan lateks sekali pakai dan masker selama operasi eksperimen.
②Memurnikan kembali cetakan DNA.

7. Informasi Pemesanan

Berikut ini adalah produk representatif yang ditawarkan oleh Yeasen. Ukuran tambahan tersedia. Produk kami sangat dioptimalkan untuk bekerja sama, guna membantu memastikan kinerja dan reproduktifitas yang unggul.
Kami juga dapat menyediakan layanan yang disesuaikan. Jika Anda tertarik pada produk yang tidak ditampilkan, hubungi kami dan kami akan bekerja sama dengan Anda untuk memenuhi kebutuhan Anda.

Tabel 2.Informasi produk

Mengenai membaca:

Reagen bermutu GMP untuk sintesis mRNA in vitro

Yeasen Bahan Baku Sintesis mRNA In Vitro Bioteknologi GMP Grade