Gambar 1: Proses transkripsi RNA in vitro

Keunggulan produk

Hasil tinggi: dapat menghasilkan hingga 200 μg dalam 2 jam melalui reaksi transkripsi

Fleksibilitas yang lebih baik: cocok untuk transkripsi RNA 20nt-10000nt

Kinerja luar biasa: secara efektif mengurangi produk sampingan transkripsi selama proses IVT

Beberapa aplikasi: dapat digunakan untuk sintesis RNA biasa, berlabel, dan dimodifikasi

Properti Produk

Gambar 2: Hasil transkrip dengan panjang yang berbeda

Gambar 3: Kualitas transkrip dengan panjang yang berbeda

Gambar 4: Ekspresi dari ditranskripsi Bahasa Indonesia: di dalam HEK-293 sel

Catatan: mRNA telah ditutup dengan Enzim Penutup Vaccinia (YeasenBahasa Indonesia: #10614/10615).

Metode Eksperimen

Reagen pencairan

Sentrifus campuran T7 RNA Polimerase sebentar dan tempatkan dia di atas es. Cairkan 10×Transcription Buffer dan ribonucleotideS (ATP, CTP, GTP, UTP), campur dan sentrifus ke dasar tabung, tempatkan 10×Bufer Transkripsi pada suhu ruangan, dan tempatkan 4 jenis ribonukleotida di atas es.

B.Reaksi transkripsi perakitan pada suhu kamar

Siapkan sistem reaksi sesuai dengan sistem berikut:

Komponen	Volume (µL)	Konsentrasi akhir
RNase bebas H2HAI	Hingga 20	-
10×Penyangga Transkripsi	2	Ukuran 1×
CTP / GTP / ATP / UTP (masing-masing 100 mM)	2 masing-masing	10 mM masing-masing
Templat DNA	1 gram	-
Campuran RNA Polimerase T7	2	-

Catatan:

1. Reaksi ini berlangsung pada suhu kamar. Karena 10× Transcription Buffer mengandung spermidine, konsentrasi spermidine yang tinggi dapat menyebabkan presipitasi cetakan DNA pada suhu rendah.
   Untuk transkrip pendek (<100 nt), templat 2 µg dapat digunakan, waktu transkripsi diperpanjang hingga 4-8 jam.
   3. Untuk transkrip panjang (>1000 nt), direkomendasikan untuk menggunakan plasmid linierisasi sebagai templat untuk transkripsi.
   4. Lakukan reaksi dalam instrumen PCR dengan tutup panas terbuka untuk mencegah penguapan.
   5. Produk reaksi mungkin memiliki endapan putih. Endapan tersebut adalah magnesium pirofosfat yang dihasilkan oleh ion pirofosfat dan magnesium bebas dalam larutan reaksi tidak mempengaruhi percobaan berikutnya. Jika ingin menghilangkannya, Anda dapat menambahkan sedikit EDTA. Jika penambahan EDTA mempengaruhi percobaan berikutnya, supernatan juga dapat diambil dengan sentrifugasi.
   6. Jaga agar reagen dan wadah bebas dari kontaminasi RNase.

C.Inkubasi pada suhu 37°C selama 2 jam

Campurkan larutan komponen, sentrifus sebentar ke dasar tabung, dan inkubasi pada suhu 37°C selama 2 jam. Jika panjang transkrip kurang dari 100 nt, perpanjang waktu reaksi menjadi 4-8 jam.

Perawatan D.DNase I (opsional)

Setelah reaksi selesai, tambahkan 2 μL DNase I (bebas RNase) ke setiap tabung dan inkubasi pada suhu 37°C selama 15 menit untuk menghilangkan DNA cetakan.

Pertanyaan yang Sering Diajukan

1. Hasil transkrip rendah

Kualitas cetakan sangat erat kaitannya dengan hasil. Hasil kelompok eksperimen jauh lebih rendah daripada kelompok kontrol. Kemungkinan penyebabnya adalah:

• Templat percobaan mengandung komponen penghambat;
• Mungkin ada yang salah pada templatnya.

Saran: ① Memurnikan kembali template; ② Menentukan kuantifikasi template dan integritasnya; ③ Memperpanjang waktu reaksi; ④ Meningkatkan jumlah input template; ⑤ Menggunakan promotor lain dan RNA polimerase lainnya.

2. Hasil transkrip pendek rendah

Fragmen templat yang pendek dapat menghambat reaksi. Jika produk transkripsi kurang dari 100 nt, jika Anda ingin meningkatkan hasil, perpanjang waktu reaksi menjadi 4-8 jam atau tingkatkan jumlah templat menjadi 2 μg.

3. Panjang transkripsi RNA adalah lebih besar dari yang diharapkan

Jika hasil elektroforesis menunjukkan pita produk lebih besar daripada ukuran yang diharapkan, kemungkinan penyebabnya adalah: ①Cetakan plasmid mungkin tidak sepenuhnya terlinearisasi; ②Ujung 3' untai penginderaan memiliki struktur yang menonjol; ③RNA memiliki struktur sekunder yang tidak sepenuhnya terdenaturasi.

Saran: ①Periksa apakah templat telah sepenuhnya dilinearisasi, dan jika perlu, lakukan linearisasi tambahan; ②Pilih enzim restriksi yang sesuai untuk menghindari overhang 3', atau gunakan Klenow Fragment /T4 DNA polimerase untuk menyelesaikan transkripsi sebelum melanjutkan; ③Gunakan gel terdenaturasi untuk mendeteksi produk RNA.

4. Panjang transkripsi RNA adalah lebih kecil dari yang diharapkan

Jika elektroforesis menunjukkan pita produk lebih kecil dari ukuran yang diharapkan, kemungkinan penyebabnya adalah: ①Templat mengandung urutan terminasi yang mirip dengan terminator RNA polimerase T7; ②Isi GC dari templatnya terlalu tinggi.

Saran: ①Turunkan suhu reaksi (misalnya, 30°C). Terkadang menurunkan suhu dapat membantu memperpanjang durasi transkripsi, tetapi mungkin juga mengurangi hasil. Coba yang lain RNA polimerase untuk transkripsi; ②Jika konten GC templat tinggi, lakukan reaksi pada suhu 42℃, atau tambahkan SSB untuk meningkatkan hasil dan panjang transkripsi.

5. Tailing elektroforesis dari produk transkripsi

Tailing selama elektroforesis dapat disebabkan oleh: ① Kontaminasi RNase selama operasi percobaan; ②Cetakan DNA terkontaminasi dengan RNase.

Saran: ①Gunakan ujung pipet dan tabung EP bebas RNase, kenakan sarung tangan lateks dan masker sekali pakai, dan semua reagen disiapkan dengan H bebas RNase₂O. ②Memurnikan kembali DNA cetakan.

Informasi pemesanan

Nama Produk	Nomor katalog	Sspesifikasi
Kit Sintesis RNA Hasil Tinggi T7	10623ES	50/100/500T
Polimerase RNA T7 kelas GMP (250 U/μL)	10625ES	10KU/100KU/2500KU/25MU
Pirofosfatase, Anorganik Kelas GMP (1 U/μL)	10620ES	10U/100U/1000U
Penghambat RNase murine kelas GMP (40 U/μL)	10621ES	10KU/20KU/100KU/1MU
Enzim Penutup Vaksin mRNA GMP-grade	10614ES	2KU/10KU/100KU
mRNA Cap 2'-O-Metiltransferase Kelas GMP	10612ES	10KU/50KU/250KU
Deoksiribonuklease I (DNase I) kelas GMP	10611ES	500/2000/10000 unit
Kit Isolasi mRNA Hieff NGS®	12603ES	24/96 T