Bagaimana Memilih Adaptor NGS Anda?
Adaptor NGS, bagian penting dari pustaka sekuensing generasi berikutnya, berperan dalam menghubungkan fragmen DNA yang diuji dan sel Flow (chip sekuensing). Efisiensi sambungan merupakan faktor penting dalam menentukan kualitas dan hasil pustaka. Jadi, apa itu adaptor NGS? Apa saja jenis adaptor NGS yang umum? Dan bagaimana cara memilih adaptor NGS yang tepat untuk platform sekuensing Anda?
1. Apa itu NGS Adapter?
2. Faktor apa yang harus Anda pertimbangkan saat memilih indeks NGS?
3. Apa saja jenis indeks yang umum?
4. Apa saja jenis adaptor NGS yang umum?
- Adaptor UMI
- Adaptor lengkap
- Adaptor tidak lengkap
- Adaptor Tn5
5. Bagaimana memilih adaptor NGS yang tepat untuk platform sequencing Anda?
6. Mengenai Membaca
1. Apa itu NGS Adapter?
Adaptor NGS, serangkaian adaptor dalam pengurutan, adalah urutan nukleotida pendek dengan urutan yang diketahui. Adaptor ini diligasikan ke kedua ujung fragmen asam nukleat target. Selama pengurutan, adaptor ini memulai pengurutan dengan melakukan hibridisasi dengan urutan yang diketahui pada sel Flow untuk menggabungkan pustaka ke chip. Jadi, apa struktur adaptor NGS?
Mengambil platform Illumina sebagai contoh, adaptor NGS dapat dibagi menjadi tiga bagian:
P5 dan P7: Urutan digabungkan dengan ujung P5 dan P7 pada sel Flow untuk memperbaiki perpustakaan pada chip pengurutan, memfasilitasi reaksi kluster melalui Bridge-PCR.
Rd1 SP dan Rd2 SP (Read1/Read2 sequencing primer): Daerah pengikatan primer sequencing, yang menunjukkan posisi saat sekuens mulai dibaca.
Indeks (juga dikenal sebagai kode batang): urutan sintetis yang diketahui digunakan untuk membedakan sampel-sampel berbeda dalam pengurutan pustaka campuran.
Ara. 1 Perpustakaan indeks tunggal platform Illumina
Ara. 2 Perpustakaan indeks ujung tunggal platform MGI
Dengan peningkatan throughput sekuensing, beberapa sampel dapat diurutkan pada saat yang sama. Jadi, cara membedakan sampel yang beragam sangatlah penting. Seperti yang disebutkan sebelumnya, sekuens indeks adaptor NGS digunakan untuk membedakan berbagai sampel dalam sekuensing generasi berikutnya (NGS). Faktor apa yang harus Anda pertimbangkan saat memilih indeks? Silakan terus membaca...
2. Faktor apa yang harus Anda pertimbangkan ketika memilih indeks?
Indeks umumnya memiliki panjang 6nt-18nt dan dibagi menjadi indeks tunggal dan indeks ganda sesuai dengan jumlah indeks. Indeks ganda terletak di kedua ujung fragmen yang akan diuji. Keseimbangan basa dan keseimbangan fluoresensi harus dipertimbangkan saat memilih kombinasi indeks.
Keseimbangan dasar mengacu pada keseimbangan antara beberapa indeks, bukan keseimbangan dasar dalam satu indeks. Hal ini perlu dipertimbangkan dari kedua jenis basis dan distribusi basis. Prinsip kombinasi adalah bahwa keempat basis A/T/C/G dalam kelompok indeks yang sama perlu disertakan, dan proporsi keempat basis ini berdekatan, masing-masing mencakup sekitar 25%.
Keseimbangan sinyal fluoresensi mengacu pada pilihan untuk memastikan keseimbangan sinyal fluoresensi ketika keseimbangan dasar tidak dapat dijamin. Dalam sequencer 4-saluran di platform Illumina, dG/dT diberi label dengan fluoresensi hijau, dan dC/dA diberi label dengan fluoresensi merah. Selama pengurutan, sinyal fluoresensi hijau dan merah harus ada di setiap siklus untuk memastikan pengurutan berhasil. Oleh karena itu, keseimbangan antara sinyal hijau dan sinyal merah harus dipertimbangkan saat memilih indeks.
3. Apa saja jenis indeks yang umum?
Indeks ganda umum biasanya mencakup Indeks Ganda Unik (UDI), Kode Batang Ganda Unik (UDB), dan Indeks Ganda Gabungan (CDI), yang secara signifikan mengurangi perpindahan indeks dan kesalahan penugasan.
UDI&UDB: indeks pada kedua ujungnya bersesuaian satu-satu, dirancang dalam kelompok, dan dapat diverifikasi silang di kedua ujungnya;
Kit Primer Stubby UDI untuk Illumina yang disediakan oleh
CDI: indeks pada kedua ujungnya dapat digabungkan sesuai dengan persyaratan tertentu untuk membentuk pustaka indeks berujung ganda;
Primer 384 CDI untuk Illumina, Set1-Set2 disediakan oleh
Untuk meningkatkan efisiensi throughput dan amplifikasi serta mengurangi biaya sequencing, Illumina memperkenalkan array flow cell (PFCT) dan teknologi pengelompokan amplifikasi eksklusif (ExAmp) untuk Novaseq dan sequencer throughput tinggi lainnya tetapi secara tidak sengaja memperkuat fenomena ketidakcocokan label sampel dan index hopping.
Gbr. 3 Model instrumen Illumina yang berbeda mengadopsi sel aliran non-pola atau sel aliran berpola
Untuk mengatasi masalah index hooping yang disorot oleh platform sekuensing seperti HiSeq3000/4000, HiSeq X Series, dan NovaSeq, Illumina mengusulkan strategi untuk menempatkan indeks di kedua ujung pustaka, yang dapat melakukan verifikasi bilateral dan menghilangkan adapter yang tidak cocok. Saat menggunakan indeks unik di kedua ujung, rasio alokasi kesalahan indeks akan berkurang hingga 0,01%. Dibandingkan dengan metode kombinasi grup permutasi indeks konvensional sebelumnya, index hopping akan berkurang dua kali lipat.
Dalam pembuatan pustaka bebas PCR, tersedia adaptor indeks ujung tunggal. Ketidakcocokan label terutama disebabkan oleh kesalahan pengurutan. Secara keseluruhan, tingkat ketidakcocokan label rendah (rata-rata 0,0004%, hingga 0,001%). Namun, dalam pembuatan pustaka tangkapan tertarget, masalah crosstalk diperkuat karena beberapa langkah akan menyebabkan ketidakcocokan label dan adaptor UDI/UDB/CDI biasanya digunakan.
4. Apa saja jenis adaptor NGS yang umum?
Dengan berkembangnya teknologi sequencing, semakin banyak jenis adapter, seperti adapter indeks tunggal/indeks ganda (seperti yang disebutkan di bagian 3), adapter UMI, adapter transposase, adapter lengkap/tidak lengkap, dll., yang cocok untuk berbagai skenario aplikasi. Bagian ini secara sistematis memilah adapter ini untuk memberi Anda dasar pemilihan adapter.
Adaptor UMI 4.1
Adaptor pengenal molekuler unik (UMI) adalah alat canggih untuk deteksi mutasi frekuensi rendah dan kuantifikasi absolut. UMI adalah urutan sintetis acak dengan urutan yang diketahui. UMI dapat dirancang sebagai rantai nukleotida yang sepenuhnya acak, rantai nukleotida degenerasi parsial, atau rantai nukleotida tetap.Panjangnya biasanya 10nt (UMI ujung tunggal) atau 5-8nt (UMI ujung ganda). Fungsinya adalah untuk membekukan keadaan fragmen DNA sebelum amplifikasi, dan setiap molekul DNA sesuai dengan UMI. Oleh karena itu, selama analisis bioinformatika, ia dapat membedakan templat DNA dari sumber yang berbeda, membedakan mana yang merupakan mutasi positif palsu yang disebabkan oleh kesalahan acak dalam proses amplifikasi dan pengurutan PCR, dan mana yang sebenarnya dibawa oleh pasien, sehingga dapat menyaring kebisingan latar belakang, mewujudkan deteksi akurat mutasi frekuensi rendah dan frekuensi sangat rendah, dan melakukan kuantifikasi absolut dari berbagai molekul DNA. Ia banyak digunakan dalam deteksi mutasi frekuensi rendah, terutama di bidang penelitian tumor.
Gambar 4 Diagram skema adaptor UMI struktur platform Illumina
4.2 Adaptor lengkap
Adaptor lengkap, produk yang diperlukan untuk pustaka bebas PCR, berisi semua sekuens yang diperlukan untuk pengurutan, seperti P5, P7, RdS1, dan RdS2 dalam platform Illumina, juga sekuens indeks dan sekuens UMI sesuai dengan persyaratan untuk pengurutan. Dengan adaptor lengkap, sekuens dapat langsung diurutkan tanpa memasukkan adaptor lain melalui PCR. Jadi, adaptor lengkap dapat digunakan untuk membangun pustaka bebas PCR. Pustaka bebas PCR dapat mengurangi bias amplifikasi PCR, tingkat kesalahan, dan duplikasi sekuens, sehingga meningkatkan cakupan beberapa daerah GC tinggi atau AT tinggi yang banyak digunakan dalam penelitian genom populasi.
Produk adaptor lengkap untuk platform Illumina yang disediakan oleh
Produk adaptor lengkap untuk platform MGI yang disediakan oleh
Gambar 5 Diagram adaptor lengkap
4.3 Adaptor yang tidak lengkap
Adaptor yang tidak lengkap perlu memasukkan sekuens lain melalui PCR setelah ligasi adaptor untuk membentuk adaptor yang lengkap. Adaptor ini dicirikan oleh efisiensi penyambungan yang tinggi dan tingkat pustaka efektif yang tinggi. Proses PCR merupakan efek pengayaan untuk pustaka yang lengkap guna memastikan konsentrasi pustaka efektif, dan juga dapat memasukkan indeks ujung ganda dan sekuens UMI.
4.4 Adaptor Tn5
Adaptor Tn5 menghubungkan bagian dari urutan adaptor ke kedua ujung fragmen DNA melalui aktivitas endonuklease restriksi Tn5. Adaptor ini membuat fragmentasi dan ligasi adaptor dilakukan secara bersamaan untuk menghemat waktu dan sampel. Terakhir, sisa urutan penghubung, indeks, UMI, dan urutan lainnya dimasukkan melalui PCR untuk membentuk pustaka yang lengkap. Adaptor ini dapat digunakan untuk membangun pustaka Cut&tag.
Gambar 6 Diagram skema konstruksi pustaka adaptor Tn5
5. Bagaimana memilih adaptor NGS yang tepat untuk platform sequencing Anda?
Saat ini, ada dua platform sekuensing utama, termasuk Illumina dan MGI.
Dalam hal platform Illumina, adaptor Illumina NGS yang dipasok oleh
Adaptor NGS yang lengkap dan UDI tidak perlu khawatir tentang masalah kopling, cocok untuk pelanggan yang menginginkan kemudahan penggunaan; adaptor NGS CDI memiliki lebih sedikit tabung dan ukuran kecil, yang cocok untuk pelanggan yang ingin menyimpan dan membawanya dengan mudah. Bebas PCR memerlukan penggunaan adaptor NGS yang lengkap.
Untuk Illumina
| Di dalam Tube | NGS yang kuat® DPersiapan Perpustakaan NA 384 CDI Primer untuk Illumina, Set 1 (8*12, indeks 96) | 12412ES |
| NGS yang kuat® DPersiapan Perpustakaan NA 384 CDI Primer untuk Illumina, Set 2 (8*12, indeks 96) | 12413ES | |
| Hieff NGS® RNA Lib Prep 384 CDI Primer untuk Illumina, Set 1 (indeks 96) | 12414ES | |
| Hieff NGS® RNA Lib Prep 384 CDI Primer untuk Illumina, Set 1 (indeks 96) | 12415ES | |
| Di Piring | Kit Primer Hieff NGS® Stubby UDI untuk Illumina (Indeks 1-384) Set 1-4 | 12407ES |
| Kit Primer Hieff NGS® Stubby UDI untuk Illumina Set 1(Plat 96 sumur, indeks 1-96) Set 1 | 12327ES | |
| Kit Primer Hieff NGS® Stubby UDI untuk Illumina Set2(Plat 96 sumur, indeks 97-192) Set ke 2 | 12328ES | |
| Kit Primer Hieff NGS® Stubby UDI untuk Illumina Set3(Plat 96 sumur, Indeks 193-288) Set ke 3 | 12329ES | |
| Kit Primer Hieff NGS® Stubby UDI untuk Illumina Set4(Plat 96 sumur, Indeks 289-384) Set ke 4 | 12330ES |
Untuk MGI
| Hieff Bahasa Indonesia: NGS™ Kit Adaptor UMI UDB Ganda untuk MGI, Set1/Set2 | 96 jenis indeks | |
| Sistem Penginderaan Jauh Hieff™ Kit Adaptor Lengkap untuk MGI, Set1/Set2/Set3 (Tanyakan) | 13360ES | 8 jenis indeks, 41-48 |
| 13361ES | 16 jenis indeks, 57-72 | |
| 13362ES | 96 jenis indeks, 1-96 |
Mengenai Membaca
Enzim kunci yang terlibat dalam konstruksi perpustakaan NGS
Tentang teknologi terkait NGS, seberapa banyak yang Anda ketahui?
Berbagai jenis manik magnetik di NGS: manik magnetik DNA\RNA\mRNA
Kuantifikasi pustaka NGS: Qubit Cepat dan Akurat atau qPCR Tepat?Semua dibutuhkan!