Berbagai jenis manik magnetik di NGS: manik magnetik DNA\RNA\mRNA
Manik-manik magnetik merupakan salah satu produk yang diperlukan dalam konstruksi pustaka sekuensing berthroughput tinggi. Manik-manik ini dapat memurnikan DNA atau RNA, menyaring fragmen DNA berukuran target, dan memperkaya asam nukleat target. Dengan perkembangan teknologi sekuensing, manik-manik magnetik yang dikhususkan dalam berbagai bidang aplikasi telah muncul, termasuk manik-manik magnetik pemurnian DNA, manik-manik magnetik pemilihan ukuran DNA, manik-manik magnetik pemurnian RNA, dan manik-manik magnetik pengayaan mRNA. Jadi, apa saja prinsip dari berbagai manik magnet? Bagaimana cara memilihnya?
Minta Sampel Gratis dan Harga Lebih Murah untuk Pembelian Grosir
1. Manik-manik DNA
2. Pengenalan manik-manik DNA bintang
3. Manik-manik pemurnian RNA
4. manik-manik magnetik yang diperkaya mRNA
5.
1. DNA Manik-manik
1.1 Prinsip dasar
Prinsip pemurnian asam nukleat dengan manik-manik magnetik didasarkan pada imobilisasi reversibel fase padat (SPRI). Dalam kondisi tertentu, asam nukleat terikat secara selektif pada manik-manik magnetik, sementara polutan tetap berada dalam larutan. Setelah menerapkan medan magnet, manik-manik magnetik yang mengikat molekul target dipisahkan dari larutan, dan kemudian manik-manik magnetik dibersihkan untuk menghilangkan polutan lebih lanjut. Karena kombinasi manik-manik magnetik dan molekul asam nukleat bersifat reversibel, asam nukleat dapat dielusi dari manik-manik magnetik dengan penyangga garam rendah.
Permukaan luar manik magnetik dimodifikasi dengan gugus fungsi silikon hidroksil atau karboksil. Dalam sistem penyangga pemurnian yang mengandung PEG dan ion garam tinggi, DNA diikat dengan manik dengan membentuk jembatan ion gugus karboksil ion garam DNA. Pengikatan ini reversibel. Jembatan ion dihilangkan dalam penyangga TE tanpa PEG dan ion garam, dan akhirnya, DNA dimurnikan. Berdasarkan manik magnetik karboksil, masukan manik magnetik dan penyangga pemurnian yang berbeda akan mengikat ukuran fragmen yang berbeda. Manik magnetik lebih suka mengikat fragmen DNA yang besar, jadi pada putaran pertama, manik magnetik digunakan untuk mengikat fragmen yang lebih besar dari fragmen target, dan supernatan dipertahankan; Pada putaran kedua, manik magnetik mengikat fragmen target dalam supernatan dan kemudian membuang supernatan; Akhirnya, fragmen target dielusi dari manik magnetik, yang fragmen DNAnya adalah ukuran target.
Gambar 1. Struktur manik magnetik karboksil
Gambar 2. Prinsip pemurnian DNA dengan manik magnetik
1.2 Proses Operasi
Gambar 3. Langkah-langkah pemurnian DNA
Gambar 4. Langkah-langkah pemilihan ukuran DNA
1.3 Tips menggunakan manik-manik magnetik
Peningkatan hasil dan pemilihan ukuran yang akurat
(1) Campur dengan baik sebelum digunakan, dan seimbangkan manik-manik magnetik pada suhu ruangan setidaknya selama 30 menit.
——Kelarutan PEG dalam manik-manik magnetik penyangga mudah terpengaruh oleh pH dan suhu.Sebelum digunakan, perlu diseimbangkan ke suhu ruangan untuk membuat manik-manik magnetik ditangguhkan secara merata dan PEG larut sepenuhnya untuk menghindari mempengaruhi efek adsorpsi dan pemisahan
(2) Waktu adsorpsi harus cukup dan tercampur sempurna untuk membuat penyerapannya memadai;
(3) Pencucian dengan etanol 80% selama pemurnian atau pemisahan;
——Di bawah 80% etanol, asam nukleat mengalami dehidrasi dan terkumpul rapat, dan tidak akan larut. Enzim sisa, penyangga, pengotor, dll. dalam sistem dibersihkan dengan etanol untuk memperoleh kemurnian yang lebih tinggi. perpustakaan.
(4) Selama pemilihan ukuran, konfirmasikan volume sampel untuk memastikan rasio penambahan manik magnetik sudah benar;
——Selama pemilihan ukuran, perlu memasukkan volume manik magnetik yang sesuai secara akurat, sehingga proporsinya akurat, karena perubahan konsentrasi PEG dan ion garam dalam penyangga dapat memengaruhi hasil.
(5) Sebelum langkah elusi, biarkan alkohol menguap sepenuhnya, tetapi mencegah manik-manik dari pengeringan berlebihan
——Umumnya, dapat dikeringkan dalam 2~3 menit. Bila jumlah manik magnet besar dan sulit dikeringkan, Disarankan untuk beroperasi dalam beberapa tabung sentrifus.
(6) Jika manik-manik magnetik menggumpal atau berbentuk lempengan, waktu elusi bisa diperpanjang setelah tercampur sempurna;
——Hal ini mungkin disebabkan oleh pengotor dalam DNA atau waktu pengeringan terlalu lama. Umumnya, bila terdapat banyak kotoran dalam DNA, disarankan untuk memurnikannya terlebih dahulu sebelum pemilihan ukuran.
2. Pengenalan manik DNA bintang
Manik seleksi DNA Hieff NGS™ didasarkan pada prinsip SPRI (solid phase reverse immobilisasi), menggunakan bahan baku manik magnetik impor, dan sistem penyangga yang dioptimalkan, yang dapat digunakan untuk pemilihan dan pemurnian ukuran fragmen DNA selama konstruksi pustaka NGS. Manik ini digunakan dengan cara yang sama seperti manik AMPure XP yang digunakan, dan efisiensi pemulihan fragmen serta distribusi ukuran pustaka sangat konsisten dengannya.
2.1 Pengenalan kinerja pemurnian
- Sistem penyangga yang unik: fragmen DNA hingga 50bp dapat dipulihkan.
- Tingkat pemulihan tinggi: ≥90%.
- Menghilangkan kotoran secara efektif: Menghilangkan kotoran seperti dimer primer, dNTP, garam anorganik, dan protein secara efektif.
- Rentang aplikasi yang luas: Cocok untuk pemurnian DNA dalam skenario seperti pencernaan enzim, ligasi, kloning, dan pembangunan perpustakaan NGS.
Tabel 1. Efisiensi pemurnian dan pemulihan DNA manik-manik magnetik dengan rasio yang berbeda
| Kelompok Pengalaman | Konsentrasi pemulihan manik-manik magnetik dalam batch ini (ng/μL) | Tingkat Pemulihan | Kelompok manik AMPure XP (ng/μl) Nomor ④ | Tingkat Pemulihan | CV% | |||
| Perbandingan | ① | ② | ③ | Rata-rata | ||||
| 1,8× | 22.2 | 23.4 | 22.8 | Nomor telepon 22.8 | 96,92% | 22.2 | 94,37% | 2,55% |
| 0,8× | 20.2 | 19.3 | 18.5 | 19.33 | 82,19% | 17.8 | 75,67% | 6,52% |
| 0,6× | 16.3 | 17.3 | 16.8 | 16.8 | 71,42% | 16.2 | 68,87% | 2,55% |
Gambar 5. Efek pemurnian hasil elektroforesis gel agarosa dari manik-manik magnetik
M：Tangga DNA 1kb;
2.2 Kinerja pemilihan ukuran
- Mudah ke beroperasi: prinsip pemisahan dan operasi eksperimental sepenuhnya konsisten dengan manik-manik magnetik XP
- Pemilihan ukuran yang akurat: ukuran fragmen yang diurutkan akurat dan stabil
- Penerapan yang luas: cocok untuk bangunan Perpustakaan DNA dan RNA dan adaptasi untuk memilih ukuran fragmen berbagai jenis sampel
- Kinerja biaya sangat tinggi: kualitas stabil, harga lebih ekonomis, layanan pra-penjualan dan purna jual yang lebih perhatian
Gambar 6. Hasil pemilihan Ukuran DNA
3. Manik-manik Pemurni RNA
Pembersih RNA Hieff NGS™ didasarkan pada prinsip SPRI, yang dapat secara efisien menghilangkan protein, ion garam, dan kotoran lainnya untuk memperoleh sampel RNA pekat dengan kemurnian tinggi, dan secara hati-hati mengoptimalkan sistem penyangga asam untuk menjaga stabilitas struktur RNA dan mencegah degradasi RNA. Produk ini cocok untuk konstruksi pustaka RNA, pemurnian sampel RNA total setelah penghilangan rRNA, pemurnian produk RNA yang ditranskripsi secara in vitro, pemurnian produk berlabel RNA, pemurnian RNA sintetis, dll.
- Kualitas tinggi: bahan baku impor, kualitas sangat stabil
- Sistem penyangga yang dioptimalkan: memastikan kemurnian dan integritas RNA dan secara efektif mencegah degradasi RNA
- Efisiensi tinggi: pemulihan yang efisien, cocok untuk konstruksi perpustakaan RNA atau in vitro pemulihan produk transkripsi, dll.
Gambar 7. Elektroforesis berbagai sampel setelah pemurnian
4. manik-manik magnetik yang diperkaya mRNA
4.1 Prinsip isolasi mRNA
Manik-manik magnetik untuk pemisahan dan pengayaan mRNA adalah manik-manik magnetik yang permukaannya dimodifikasi dengan oligo (dT). Melalui prinsip hibridisasi, manik-manik ini dapat secara khusus mengikat mRNA dengan ekor Poly A dan secara khusus memisahkan mRNA dari total RNA atau sel jaringan. Kit dengan formula produk yang dioptimalkan ini dapat secara efisien mengisolasi mRNA lengkap dengan kemurnian tinggi dari RNA sel dan jaringan hewan, tumbuhan, serangga, dan mikroorganisme eukariotik.
Gambar 8.prinsip pengayaan dan pemurnian manik magnetik mRNA
4.2 Kinerja manik isolasi mRNA
Kit Master Isolasi mRNA Hieff NGS™ dikembangkan secara independen oleh
- Efisiensi tinggi: pemurnian mRNA dapat diselesaikan dalam waktu 45 menit
- Kemurnian tinggi: manik-manik magnetik oligo (dT) secara khusus mengikat mRNA
- Dapat diandalkan: mRNA yang diperoleh cocok untuk NGS, in vitro terjemahan, RT-PCR, dan sintesis cDNA
Gambar 9. Kit isolasi mRNA memurnikan mRNA dari sampel RNA yang berbeda
Catatan: housekeeping gene yield menunjukkan efek pemulihan mRNA. rRNA related gene yield Karakterisasi efisiensi penghilangan rRNA
4.3 Tanya Jawab manik magnetik mRNA
(1) Mengapa manik-manik magnetik menggumpal dan bagaimana mengatasinya?
——Manik-manik magnetik Penggumpalan akan mengurangi hasil dan kemurnian mRNA. Sampel mungkin mengandung banyak kotoran, seperti polisakarida, protein, dan DNA rantai panjang. Kotoran ini akan menyebabkan manik-manik magnetik penggumpalan. Solusinya adalah meniupkan manik-manik magnetik melalui pipet. DNA genom dapat dihilangkan melalui perlakuan DNase sebelum pemurnian. Jika ukuran sampel awal terlalu besar dan melebihi beban manik-manik magnetik, manik-manik magnetik juga akan menggumpal. Sebaiknya operasikan sesuai dengan jumlah yang dimasukkan dalam manual.
(2) Mengapa hasil mRNA rendah?
——Ada banyak alasan untuk hasil mRNA yang rendah:
- Tingkat ekspresi mRNA sel atau jaringan rendah, sehingga kita dapat memilih sampel periode ekspresi yang tepat atau meningkatkan jumlah total masukan RNA sampel dengan tepat.
- Rasio manik-manik magnetik terhadap sampel terlalu rendah, yang memengaruhi kombinasi mRNA dan manik-manik magnetik. Cobalah untuk meningkatkan jumlah manik magnetik atau mengurangi jumlah dan volume masukan sampel.
- Waktu hibridisasi terlalu pendek, waktu inkubasi dapat ditingkatkan menjadi 10-15 menit;
- Elusinya tidak mencukupi, perlu meningkatkan volume buffer elusi secara tepat, meningkatkan waktu dan suhu elusi, atau mengulangi langkah elusi dua kali.
(3) Bagaimana cara menghilangkan rRNA secara efektif?
——Jika operasi tidak tepat, rRNA akan terikat secara non-spesifik pada manik-manik magnetik bersama dengan mRNA selama pemurnian, terutama ketika ada masukan RNA total dalam jumlah besar. Dua putaran pengikatan biasanya digunakan dalam proses pemurnian untuk menghindari polusi rRNA secara efektif. Pastikan tercampur sepenuhnya selama percobaan pencucian untuk menghilangkan ikatan non-spesifik dan mencoba menghilangkan polusi rRNA.
(4) Untuk banyak aplikasi hilir, apakah perlu mengelusi mRNA, dan apakah manik magnetik akan mengganggu reaksi enzim hilir?
——Beberapa reaksi hilir dapat dilakukan langsung dengan manik magnetik tanpa mengeluarkan mRNA, seperti fragmentasi mRNA dan transkripsi balik dalam pembangunan perpustakaan RNA.Namun, jika reaksi PCR akan dilakukan, perlu dipastikan tidak ada pencemaran DNA genomik, jika tidak akan dihasilkan banyak fragmen amplifikasi genomik, yang akan mengganggu hasil eksperimen. Operasi terperinci dapat dilakukan sesuai dengan petunjuk reaksi hilir yang sesuai, seperti konstruksi pustaka RNA-Seq
(5) Bisakah kit memisahkan mRNA langsung dari sel atau jaringan?
——Tidak direkomendasikan! Lisat mengandung beberapa komponen yang akan memengaruhi pengikatan mRNA. Sebaiknya gunakan kit khusus.
5. Yeasen Rekomendasi produk manik-manik magnetik
Manik-manik magnetik seri Hieff NGS™ sebagai
Tabel 2.
| Nama Produk | Kucing# | Spesifikasi | Skenario penggunaan dan aplikasi |
| NGS™ yang canggih Manik-manik Seleksi DNA | Nomor telepon 12601ES03 | 1 ml air | 👉DNA NGS pemurnian dan pemilihan ukuran 👉Pemurnian produk PCR 👉Pemurnian produk pencernaan dan ligasi enzim |
| nomor telepon 12601ES08 | 5 ml air | ||
| 12601ES56 | 60 ml air | ||
| 12601ES75 | 450 ml air | ||
| Sistem Penginderaan Jauh Hieff™ Pembersih RNA | nomor 12602ES03 | 1 ml air | 👉Pemurnian RNA 👉Pemurnian total sampel RNA setelah penghilangan rRNA 👉Pemurnian produk berlabel RNA |
| nomor 12602ES08 | 5 ml air | ||
| 12602ES56 | 60 ml air | ||
| nomor 12602ES75 | 450 ml air | ||
| Kit Isolasi mRNA Hieff NGS™ | nomor telepon 12603ES24 | 24 jam | 👉Isolasi dan pemurnian mRNA 👉Pemurnian mRNA transkripsi in vitro |
| 12603ES96 | 96 jam |
Mengenai Membaca
Tentang teknologi terkait NGS, seberapa banyak yang Anda ketahui?
5 menit untuk memahami masa lalu dan masa kini manik-manik seleksi DNA (termasuk analisis hasil dan interpretasi FAQ)