Panduan Komprehensif untuk Budidaya Organoid

— Artikel komprehensif untuk memperdalam pemahaman Anda tentang organoid.

Pengantar Organoid

Organoid adalah struktur tiga dimensi dengan fungsi fisiologis yang meniru keadaan normal (atau sakit) organ atau jaringan internal, yang dicapai melalui kultivasi 3D di luar tubuh. Dalam istilah yang lebih sederhana, organoid adalah kultur sel tiga dimensi tempat sel induk dikultur dalam gel matriks. Di bawah pengaruh inhibitor/aktivator kimia, sitokin, dan aditif kultur, organoid berkembang menjadi struktur jaringan yang mirip dengan organ terkait.

Karakteristik Organoid

Organoid memiliki kemampuan pembaruan diri, menjaga struktur fisiologis dan fungsi jaringan sumber. Organoid sering disebut sebagai "organ mikro dalam cawan." Dengan memanfaatkan kemampuan pembaruan diri, diferensiasi, dan pengorganisasian diri sel punca, organoid dapat dikriopreservasi untuk digunakan dalam biobank dan dapat mengalami ekspansi tanpa batas. Organoid sangat kompleks dan, dibandingkan dengan sel 2D, lebih menyerupai keadaan in vivo.

Gambar 1. Budidaya organoid sel adenokarsinoma usus besar manusia [1]

Aplikasi Organoid

Ciri khas organoid adalah kemampuannya untuk mensimulasikan lingkungan in vivo dengan lebih baik, sehingga cocok untuk analisis biologi molekuler dan seluler. Dengan menjembatani kesenjangan antara tingkat hewan dan seluler, organoid menawarkan solusi yang unggul untuk penelitian di berbagai bidang seperti studi tumor, penyaringan obat, pengobatan regeneratif, dan banyak lagi. Organoid telah banyak digunakan dalam induksi jaringan fungsional, pembentukan model penyakit, penyaringan obat, uji antiinflamasi, penelitian klinis, dan berbagai aspek penelitian lainnya, yang menunjukkan potensi besar baik dalam penelitian dasar maupun aplikasi translasi.

Seiring terus berkembangnya sistem budidaya organoid dan teknik eksperimen, organoid telah digunakan untuk berbagai jaringan dan organ, termasuk usus (usus halus/kolon), lambung, hati, jantung, paru-paru, prostat, pankreas, ginjal, payudara, struktur mirip otak, retina, telinga bagian dalam, dan masih banyak lagi.

Organoid yang berasal dari sel induk tumor telah menunjukkan potensi signifikan dalam memahami mekanisme kemunculan dan perkembangan tumor, menyaring sensitivitas obat, dan mendorong pengobatan presisi serta diagnosis yang dipersonalisasi. Beberapa artikel dari Cell dan Science menunjukkan bahwa organoid menunjukkan sensitivitas dan spesifisitas tinggi dalam memprediksi efektivitas obat antikanker. Baru-baru ini, organoid tumor telah menunjukkan perannya dalam memprediksi respons pasien terhadap obat kanker dan membantu dalam perumusan rencana perawatan yang dipersonalisasi.

Meneliti Mekanisme Perkembangan: Kemampuan diferensiasi organoid membuatnya cocok untuk mempelajari proses dan mekanisme perkembangan embrio. Proses induksi yang diatur oleh jalur pensinyalan seperti Wnt dan BMP dapat digunakan untuk mempelajari perkembangan organ seperti otak, pankreas, dan lambung [2][3][4].

Menetapkan Model Cedera Penyakit: Organoid yang diinduksi dari jaringan atau organ tertentu dapat digunakan untuk mempelajari model penyakit tertentu. Tim yang dipimpin oleh Zhao Bing dan Lin Xinhua menggunakan model infeksi organoid manusia untuk mempelajari mekanisme molekuler infeksi SARS-CoV-2 dan kerusakan hati, menyediakan alat penting untuk meneliti mekanisme patogenik virus dan pengembangan obat selanjutnya [5]. Kelompok penelitian yang dipimpin oleh Deng Hongkui di Sekolah Ilmu Hayati Universitas Peking menggunakan molekul kecil dan sitokin untuk merangsang pembangunan organoid usus baru dengan fitur regenerasi kerusakan—Hyper Organoid.Organoid ini dapat diwariskan dan diperkuat untuk jangka waktu yang panjang, mempertahankan genom dan mendorong perbaikan kerusakan jaringan usus besar, meringankan gejala patologis pada model hewan kolitis akut, dan banyak lagi [6].

Pengobatan Regeneratif: Organoid yang berasal dari sel punca dapat memperbaiki atau mengganti jaringan yang rusak atau sakit untuk memulihkan fungsi jaringan normal. Organoid ini memiliki aplikasi yang luas dalam terapi sel, termasuk untuk penyakit neurodegeneratif lainnya, diabetes, penyakit kardiovaskular, gangguan retina, cedera sumsum tulang belakang, dan banyak lagi. Sebagai pengobatan baru di bidang pengobatan regeneratif—DA01, menggunakan molekul kecil seperti SB-431542, LDN193189, CHIR-99021, Y-27632, dan protein Sonic Hedgehog (Shh), merangsang sel punca pluripoten untuk berdiferensiasi menjadi neuron dopaminergik. Neuron ini kemudian ditransplantasikan ke area otak yang cedera pada pasien penyakit Parkinson stadium akhir, yang memberikan arah dan pendekatan baru untuk pengobatan penyakit ini [7].

Pengujian Toksisitas dan Khasiat Obat: Organoid dapat digunakan untuk memverifikasi farmakotoksisitas obat baru pada organ atau jaringan tertentu, sehingga memberikan dukungan data untuk pengembangan obat baru. Penggunaan organoid ginjal Hyman untuk memverifikasi toksisitas ginjal Cisplatin adalah salah satu contohnya [8].

Penyaringan Obat: Organoid yang berasal dari sel induk dapat digunakan untuk pengujian reaksi obat secara in vitro, yang memberikan dukungan teoritis untuk penyaringan obat. Organoid kolon dapat digunakan untuk mempelajari rencana pengobatan untuk pasien dengan mutasi CFTR, dan organoid tumor dapat digunakan untuk menilai situasi pengobatan individual untuk pasien [9].

Sejarah Perkembangan Organoid

Sumber Organoid

Organoid normal utamanya berasal dari sel punca, termasuk sel punca pluripoten (PSC) dan sel punca dewasa (ASC). Sel punca pluripoten meliputi sel punca embrionik (ESC) dan sel punca pluripoten terinduksi (iPSC). Dibandingkan dengan sel punca pluripoten, sel punca dewasa memiliki kelebihan karena lebih sederhana dan lebih cepat dimodelkan, tetapi kekurangannya adalah membangun struktur organoid yang relatif lebih sederhana. Struktur organoid yang dibangun dari sel punca pluripoten lebih kompleks.

Produk yang digunakan dalam Budidaya Organoid

Molekul Kecil yang Umum Digunakan dalam Kultur Organoid (Ringkasan): Sangat praktis, jangan lupa untuk menandainya!

❶ Y-27632 (Cat#53006ES, Cat#52604ES): Penghambat kuat Rock, secara kompetitif menghambat p160ROCK (Ki=140 nM) dan ROCK-II (IC50=800 nM) melalui kompetisi ATP.Zat ini juga menghambat PRK2 (IC50=600 nM). Biasanya ditambahkan selama penyemaian pertama dalam kultur plat; perubahan medium berikutnya mungkin tidak memerlukan penambahan. Perlakuan sel induk embrionik manusia dengan Y-27632 (10 µM) selama 1 jam dapat menghambat apoptosis, meningkatkan efisiensi klon, dan memperpanjang lintasan sel.

Konsentrasi kerja yang disarankan: 10 μM

❷ SB-202190 (Cat#53005ES): Inhibitor kinase p38 MAPK yang efisien, menargetkan p38α/β. SB202190 dapat menginduksi diferensiasi sel punca embrionik manusia menjadi sel otot jantung, mendorong pembaruan diri sel punca saraf, dan dapat diaplikasikan pada kultur organoid gastrointestinal dan kelenjar susu.

Konsentrasi pelarutan yang disarankan: Larutkan 10 mg dalam 3,018 mL DMSO untuk mendapatkan larutan 10 mM; simpan pada suhu -20℃.

Konsentrasi kerja yang disarankan: 10 μM

❸ CHIR-99021 (Cat#53003ES): Turunan aminopirimidin, yang bertindak sebagai penghambat GSK-3 (GSK3α/β). Obat ini menginduksi diferensiasi sel induk embrionik manusia ke dalam endoderm dan digunakan dalam kultur organoid ginjal dan retina. CHIR-99021, bila digunakan dalam kombinasi dengan reagen lain, merangsang pemrograman ulang sel somatik menjadi sel induk.

Konsentrasi pelarutan yang disarankan: Larutkan 5 mg dalam 3,58 mL DMSO untuk mendapatkan larutan 3 mM; simpan pada suhu -20℃.

Konsentrasi kerja yang disarankan: 3 μM

❹ A 83-01 (Cat#53002ES): Penghambat jalur Activin/NODAL/TGF-β, yang menghambat aktivitas kinase ALK5/4/7. Umumnya digunakan dalam kultur organoid hati, prostat, dan kelenjar susu. Umumnya digunakan untuk menghambat diferensiasi sel punca pluripoten terinduksi (iPSC) dan mempertahankan pembaruan diri sel secara in vitro.

Konsentrasi pelarutan yang disarankan: Larutkan 5 mg dalam 5,93 mL DMSO untuk memperoleh larutan 2 mM; simpan pada suhu -20℃. (Catatan: Produk ini tidak stabil dalam larutan dan direkomendasikan untuk segera digunakan setelah persiapan.)

Konsentrasi kerja yang disarankan: 2 μM

❺ Gastrin I (Cat#53007ES): Gastrin adalah hormon peptida gastrointestinal endogen yang merangsang sel dinding lambung untuk mengeluarkan asam lambung. Hormon ini penting untuk penelitian organoid gastrointestinal. Saat membudidayakan organoid usus dan hati, penambahan gastrin membantu memperpanjang waktu bertahan hidup organoid.

Konsentrasi pelarutan yang disarankan: Larutkan 1 mg dalam 2,38 mL larutan amonia 1% untuk mendapatkan larutan 0,2 mM; simpan pada suhu -20℃.

Konsentrasi kerja yang disarankan: 10 nM

❻ Nikotinamida (Cat#51402ES): Nikotinamida, vitamin B3, berpartisipasi dalam berbagai reaksi redoks enzimatik dan digunakan dalam kultur organoid gastrointestinal, hati, dan kelenjar susu. Nikotinamida, bersama dengan sitokin dan reagen biokimia lainnya, menunjukkan sifat antiinflamasi, mendorong diferensiasi sel punca mesenkimal menjadi sel penghasil insulin, menghambat aktivitas sirtuin, dan digunakan untuk mendorong pembentukan organoid dan memperpanjang umur organoid.

Konsentrasi pelarutan yang disarankan: Larutkan 100 mg dalam 8,19 mL H2O (atau DMSO) untuk mendapatkan larutan 100 mM; simpan pada suhu -20℃.

Konsentrasi kerja yang disarankan: 10 mM

❼ Forskolin (Cat#51001ES): Forskolin dapat mengaktifkan adenilat siklase, yang umumnya digunakan untuk meningkatkan kadar cAMP intraseluler. Forskolin menginduksi diferensiasi berbagai jenis sel, mengaktifkan PXR dan FXR, serta memiliki efek antiagregasi trombosit dan antihipertensi. Saat membudidayakan organoid hati, penting untuk menambahkan zat ini.

Konsentrasi kerja yang disarankan: 1-10 μM

❽ Prostaglandin E2 (Cat#60810ES): Prostaglandin E2 (PGE2) mengatur banyak sistem fisiologis, memediasi proliferasi dan diferensiasi sel.Diperlukan saat membudidayakan organoid hati dan prostat dan dikaitkan dengan relaksasi otot polos, peradangan, reproduksi, pengaturan siklus tidur, dan integritas mukosa lambung.

Konsentrasi pelarutan yang disarankan: Larutkan 1 mg dalam 0,28 mL DMSO untuk mendapatkan larutan 10 mM; simpan pada suhu -20℃.

Konsentrasi kerja yang disarankan: 500 nM

❾ N-asetil-L-sistein (Cat#50303ES): N-asetil-L-sistein (NAC) merupakan prekursor antioksidan glutathione, dengan efek antioksidan dan penghambat ROS. Zat ini menghambat apoptosis sel saraf dan diperlukan dalam proses kultur sebagian besar organoid.

Konsentrasi pelarutan yang disarankan: Larutkan 2 g dalam 24,51 mL H2O (atau DMSO) untuk mendapatkan larutan 500 mM; simpan pada suhu -20℃.

Konsentrasi kerja yang disarankan: 1 mM

Informasi produk terkait

Referensi：

[1] Sato T, Stange DE, dkk.Perluasan jangka panjang organoid epitel dari usus besar manusia, adenoma, adenokarsinoma, dan epitel Barrett. Gastroenterologi. 2011 November;141(5):1762-72. doi: 10.1053/j.gastro.2011.07.050. Epub 2011 September 2. PMID: 21889923.

[2] Lancaster MA, Renner M, dkk. Organoid serebral memodelkan perkembangan otak manusia dan mikrosefali. Alam. 2013.501(7467):373-379. http://dx.doi.org/10.1038/nature12517.

[3] Greggio C, dkk. Relung tiga dimensi buatan mendekonstruksi perkembangan pankreas secara in vitro. Pengembangan. 2013.140(21):4452-4462. http://dx.doi.org/10.1242/dev.096628.

[4] McCracken KW, dkk. Pemodelan perkembangan dan penyakit manusia pada organoid lambung yang berasal dari sel induk pluripoten. Nature. 2014.516(7531):400-404. http://dx.doi.org/10.1038/nature13863.

[5] Zhao B, Ni C, dkk. Rekapitulasi infeksi SARS-CoV-2 dan kerusakan kolangiosit dengan organoid duktal hati manusia. Protein Cell. 2020 Okt;11(10):771-775. doi: 10.1007/s13238-020-00718-6. PMID: 32303993; PMCID: PMC7164704.

[6] Qu M, Xiong L, dkk. Pembentukan kultur organoid usus yang memodelkan regenerasi epitel terkait cedera. Cell Res. 2021 Maret;31(3):259-271. doi: 10.1038/s41422-020-00453-x. Terbit secara elektronik 8 Januari 2021. PMID: 33420425; PMCID: PMC8027647.

[7] BlueRock Therapeutics Mengumumkan Pasien Pertama yang Diberi Dosis DA01 dalam Studi Fase 1 pada Pasien dengan Penyakit Parkinson Tingkat Lanjut. Siaran Pers BlueRock Therapeutics: 8 Juni 2021.

[8] Takasato M, Er PX, dkk. Organoid ginjal dari sel iPS manusia mengandung beberapa garis keturunan dan memodelkan nefrogenesis manusia. Alam. 2015.526(7574):564-568. http://dx.doi.org/10.1038/nature15695.

[9] Spence JR, Mayhew CN, dkk. Diferensiasi terarah sel induk pluripoten manusia ke dalam jaringan usus secara in vitro. Alam. 2011.470(7332):105-109. http://dx.doi.org/10.1038/nature09691.