Kit Analisis Fragmen DNA Residu Sel Host HEK293 dirancang untuk analisis kuantitatif fragmen DNA residu HEK293 dengan berbagai panjang dalam produk antara, produk setengah jadi, dan produk akhir sediaan biologis. Kit ini menggunakan prinsip probe fluoresensi qPCR untuk mendeteksi residu DNA HEK293 secara spesifik dan cepat baik di bawah maupun di atas 200 pasangan basa, dengan batas kuantifikasi serendah 10 fg/μL. Kit ini juga mencakup Kontrol DNA HEK293 (referensi kuantitatif DNA). Kit ini dapat digunakan bersama dengan kit sediaan sampel DNA residu berbasis manik magnetik milik perusahaan (Kucing#18461ES/18462ES).

Informasi produk

Komponen

Penyimpanan dan pengiriman:

1. Semua komponen dikirim dalam bentuk es kering dan harus disimpan pada suhu -25°C hingga -15°C setelah diterima. Masa simpannya adalah 2 tahun. Komponen A dan B1, B2, B3, dan B4 harus disimpan di tempat yang terlindung dari cahaya.

2. Setelah diterima, verifikasi bahwa ketujuh komponen ada dan segera simpan pada suhu yang disarankan.

Tindakan pencegahan:

1. Produk ini ditujukan untuk tujuan penelitian saja.

2. Demi alasan keselamatan dan kesehatan, harap kenakan jas laboratorium dan sarung tangan sekali pakai selama bekerja.

3. Sebelum menggunakan reagen ini, bacalah buku petunjuk dengan saksama. Percobaan harus dilakukan dengan mengikuti prosedur standar, termasuk penanganan sampel, persiapan campuran reaksi, dan pemipetan.

4. Setiap komponen harus dicampur secara menyeluruh dengan mengocoknya perlahan dan disentrifugasi sebentar sebelum digunakan.

Instrumen yang Kompatibel:

Termasuk namun tidak terbatas pada instrumen berikut: Thermo Scientific: ABI 7500, ABI Quant Studio 5, ABI Step OnePlusBahasa Indonesia: Bio-Rad: Modul Optik CFX96Bahasa Indonesia: Teknologi Medis Shanghai Hongshi: SLAN-96S

Petunjuk Penggunaan

1. Pengenceran DNA HEK293 Kontrol Referensi Kuantitatif dan Persiapan Kurva Standar

Kit Analisis Fragmen HEK293 mencakup empat fragmen amplifikasi dengan panjang yang berbeda: 82 bp, 133 bp, 227 bp, dan 515 bp. Saat membuat kurva standar, buat kurva terpisah untuk setiap fragmen amplifikasi dan hitung jumlah residu dan distribusi relatifnya berdasarkan kurva standar yang sesuai.

Gunakan Penyangga Pengenceran DNA yang disediakan dalam kit untuk melakukan pengenceran gradien pada Referensi Kuantitatif Kontrol DNA HEK293. Konsentrasi pengenceran harus: 3 ng/μL, 300 pg/μL, 30 pg/μL, 3 pg/μL, 300 fg/μL, dan 30 fg/μL.

Dengan rincian sebagai berikut

1). Letakkan HEK293 DNA Control dan DNA Dilution Buffer dari kit di atas es untuk dicairkan. Setelah pencairan selesai, putar perlahan untuk mencampur dan sentrifus sebentar (10 detik) untuk mengumpulkan larutan di dasar tabung.

2)Siapkan enam tabung sentrifus 1,5 mL yang bersih dan beri label Std0, Std1, Std2, Std3, Std4, dan Std5.

3). Dalam tabung berlabel Std0, tambahkan 90 μL DNA Dilution Buffer dan 10 μL HEK293 DNA Control untuk mencapai konsentrasi 3 ng/μL. Aduk perlahan untuk mencampur dan sentrifus sebentar (10 detik). Konsentrasi ini dapat dibagi dan disimpan pada suhu -20°C untuk penggunaan jangka pendek (hingga 3 bulan). Hindari siklus beku-cair berulang.

4). Dalam tabung berlabel Std0, Std1, Std2, Std3, Std4, dan Std5, pertama-tama tambahkan 90 μL DNA Dilution Buffer ke masing-masing tabung. Setiap langkah pengenceran harus dicampur dengan lembut dan disentrifugasi sebentar untuk memastikan keseragaman. Kemudian lakukan gradien pengenceran sebagai berikut:

Tabel 1: Pengenceran Gradien Standar

* Untuk setiap konsentrasi, lakukan 3 kali replikasi. Reagen ini dapat menguji dalam rentang linier 300 pg/μL hingga 30 fg/μL. Jika diperlukan, rentang linier dapat diperluas atau dipersempit dengan tepat.

** Untuk mengurangi siklus beku-cair yang berulang dan menghindari kontaminasi, disarankan untuk melakukan alikuot dan menyimpan sampel kuantifikasi DNA. Sstandar pada -20°C untuk penggunaan pertama.

*** Pengenceran DNA yang tidak digunakan dan sudah dicairkan dapat disimpan pada suhu 2-8°C hingga 7 hari. Jika tidak digunakan dalam jangka waktu lama, simpan pada suhu -20°C.

**** Untuk memastikan pencampuran templat menyeluruh, kocok perlahan setiap pengenceran gradien selama sekitar 1 menit.

2. Persiapan Sampel Uji (TS)

Siapkan sampel uji TS sesuai dengan pengaturan percobaan, sebagai berikut:

1) Ambil 100 μL sampel uji dan masukkan ke dalam tabung sentrifus bersih 1,5 mL. Beri label sebagai TS, lakukan pra-perlakuan sampel, dan siapkan tHai murnioleh itu sampel uji.

2) Untuk memenuhi persyaratan analisis empat panjang ekstensi yang berbeda secara bersamaan, jumlah sampel uji yang telah diolah terlebih dahulu harus ≥120 μL. Oleh karena itu, disarankan untuk menyiapkan 2 tabung dari setiap sampel untuk pengolahan awal, dan setelah ekstraksi, campurkan semuanya untuk digunakan.

3. Penyusunan Kontrol Ekstraksi Negatif (NCS)

Siapkan kontrol ekstraksi negatif NCS sesuai dengan pengaturan percobaan, sebagai berikut:

1) Ambil 100 μL larutan matriks sampel (atau pengenceran DNA penyangga) dan masukkan ke dalam tabung sentrifus bersih berukuran 1,5 mL. Beri label NCS.

2) Lakukan pra-perlakuan sampel kontrol negatif NCS bersama dengan kumpulan sampel uji dan siapkan larutan kontrol negatif NCS yang dimurnikan.

3) Untuk memenuhi persyaratan analisis empat panjang ekstensi yang berbeda secara bersamaan, jumlah sampel NCS yang telah diolah terlebih dahulu harus ≥120 μL. Oleh karena itu, disarankan untuk menyiapkan 2 tabung dari setiap sampel NCS untuk pengolahan awal, dan setelah ekstraksi, campurkan keduanya untuk digunakan.

4. Persiapan Kontrol Tanpa Template (NTC)

Siapkan NTC kontrol tanpa template sesuai dengan pengaturan percobaan, sebagai berikut:

1) No Template Control (NTC) tidak memerlukan sampel pra-perawatan, dan dapat disiapkan mulai dari tahap mendeteksi kandungan DNA residu menggunakan qPCR.

2) Untuk setiap tabung atau sumur, sampel NTC terdiri dari 20 μL campuran (yaitu, 15 μL Campuran HEK293 qPCR + 5 μL Campuran Primer & Probe HEK293 yang sesuai) + 10 μL Penyangga Pengenceran DNA. Sebaiknya persiapkan cukup untuk 3 sumur replikasi.

5. Sistem reaksi qPCR

Meja 2. Sistem reaksi untuk fragmen 82 bp

Meja 3. Sistem reaksi untuk 133 fragmen bp

Meja 4. Sistem reaksi untuk 227 fragmen bp

Meja 5. Sistem reaksi untuk 515 fragmen bp

* Untuk menghitung jumlah total Campuran yang diperlukan untuk reaksi ini berdasarkan jumlah sumur:

Campuran = (Jumlah sumur reaksi + 2) × (15 + 5) μL (untuk memperhitungkan hilangnya 2 sumur). Biasanya, 3 sumur replikasi disiapkan untuk setiap sampel.

** Jumlah sumur reaksi = (5 sumur kurva standar gradien konsentrasi + 1 Kontrol Tanpa Templat (NTC) + 1 Larutan Kontrol Negatif (NCS) + N Sampel Uji (TS)) × 3.

NTC (Tanpa Kontrol Template): Penyangga Pengenceran DNA

NCS (Negative Control Solution): Larutan matriks sampel atau Penyangga Pengenceran DNA setelah sampel pra-perlakuan untuk mendapatkan larutan murni, yaitu NCS.

TS (Sampel Uji): Sampel yang akan diuji.

***Setelah mengeluarkan sampel dan menyegel tabung, sentrifus sebentar pada kecepatan rendah (10 detik) untuk mengumpulkan cairan dari dinding tabung ke dasar. Kemudian putar selama minimal 5 detik untuk mencampur secara menyeluruh. Setelah itu, lakukan sentrifus kecepatan rendah lagi (10 detik). Jika ada gelembung, pastikan untuk membuangnya.

Tabel 6: Tata Letak Plat Referensi

Contoh ini menunjukkanadalah prosedur deteksi qPCR untuk menganalisis fragmen amplifikasi DNA HEK293 yang tersisa.Sampel uji meliputi: 5 gradien konsentrasi kurva standar DNA HEK293, 1 sampel uji (TS), 1 larutan kontrol negatif (NCS), dan 1 kontrol tanpa templat (NTC). Sebaiknya dilakukan 3 sumur replikasi untuk setiap sampel.

6. Parameter Program Amplifikasi (Ttiga(Metode -langkah) (Contoh menggunakan Instrumen ABI 7500 qPCR, Versi Perangkat Lunak 2.0)**

1) Buat program kosong baru dan pilih "Absolute Quantification" sebagai templat deteksi.

2) Untuk empat panjang fragmen amplifikasi yang berbeda, buat probe deteksi baru, beri nama "HEK293-82", "HEK293-133", "HEK293-227", dan "HEK293-515"Pilih fluorofor reporter sebagai "FAM" dan fluorofor peredam sebagai "none". Atur pewarna referensi untuk deteksi sebagai "ROX" (pewarna referensi dapat ditambahkan atau tidak tergantung pada model instrumen dan faktor lainnya).

3) Pada panel "Tetapkan target ke sumur yang dipilih", atur bidang "Tugas" untuk sumur kurva standar sebagai "Standar", dan tetapkan nilai yang sesuai di bidang "Kuantitas" sebagai "300000", "30000", "3000", "300", "30" (mewakili konsentrasi DNA per sumur, dalam fg/μL). Beri nama sumur di kolom "Nama Sampel" sebagai "300 pg/μL", "30 pg/μL", "3 pg/μL", "300 fg/μL", "30 fg/μL". Untuk sumur NTC, atur "Tugas" ke "NTC". Untuk sumur NCS dan TS, atur "Tugas" ke "Tidak Diketahui", dan beri nama sumur "NCS" dan "TS" di kolom "Nama Sampel". Setelah mengatur parameter ini, klik "Mulai Jalankan" untuk memulai pengoperasian instrumen.

4) Pengaturan program amplifikasi: Atur program amplifikasi tiga langkah, dengan volume reaksi 30 μL.

MejaNomor telepon 7. Prosedur PCR

7. Analisis Hasil qPCR

1) Pada panel "Analysis" di bawah "Amplification Plot," sistem akan secara otomatis menetapkan "Threshold." Terkadang, "Threshold" default terlalu dekat dengan garis dasar, yang menyebabkan variasi Ct yang signifikan di antara replikasi. Anda dapat menyesuaikan "Threshold" secara manual ke posisi yang sesuai dan mengeklik "Analyze." Pada titik ini, Anda dapat memeriksa kurva amplifikasi di "Multicomponent Plot" untuk melihat apakah kurva tersebut normal.

2) Pada panel "Analisis" di bawah "Kurva Standar," Anda dapat membaca kurva standar R², efisiensi amplifikasi (Eff%), kemiringan, dan intersep. Untuk kurva standar normal: R² > 0,99, efisiensi amplifikasi (90% ≤ Eff% ≤ 110%), dan kemiringan antara -3,6 dan -3,1.

3) Pada panel "Analisis" di bawah "Lihat tabel sumur," Anda dapat membaca kolom "Kuantitas" untuk kontrol tanpa templat (NTC), kontrol negatif (NCS), dan sampel uji (TS), dengan satuan fg/μL. Satuan tersebut dapat dikonversi nanti dalam laporan.

4) Pengaturan parameter untuk analisis hasil harus bergantung pada model instrumen dan versi perangkat lunak tertentu. Biasanya, instrumen dapat secara otomatis menginterpretasikan hasil.

5) Nilai Ct dari kontrol negatif (NCS) harus lebih besar dari nilai Ct rata-rata konsentrasi terendah kurva standar.

6) Hasil kontrol tanpa template (NTC) harus "Tidak ditentukan" atau memiliki nilai Ct ≥ 32.

Dokumen

Buku petunjuk