Con l'avanzamento della terapia con cellule staminali e lo sviluppo di farmaci basati su organoidi, la matrice della membrana basale svolge un ruolo fondamentale come nutriente e vettore di supporto per colture di cellule staminali e organoidi, colture cellulari 3D e altre applicazioni tra cui angiogenesi, esperimenti di tumorigenesi in vivo, ecc. Gli estratti di membrana basale Ceturegel™ vengono estratti da tumori di topo Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) ricchi di proteine ​​della matrice extracellulare tra cui laminina, collagene di tipo IV, nestina, ecc. IGF, FGF e altri fattori di crescita. A temperatura ambiente, la matrice della membrana basale Ceturegel™ polimerizza per formare una matrice tridimensionale biologicamente attiva. Può simulare la struttura, la composizione, le proprietà fisiche e le funzioni della membrana basale cellulare in vivo, il che è vantaggioso per la coltura e la differenziazione delle cellule in vitro ed è una buona alternativa al matrigel.

1. Che cos'è la matrice della membrana basale Ceturegel™?
2. Qual è il ruolo della matrice della membrana basale Ceturegel™?
3. Quali sono le caratteristiche della matrice della membrana basale Ceturegel™?
4. L'applicazione popolare della matrice della membrana basale Ceturegel™
5. Domande frequenti
6. La guida alla selezione della matrice della membrana basale Ceturegel™ di Yeasen

1. Che cos'è la matrice della membrana basale Ceturegel™?

La matrice adiacente alle cellule endoteliali, epiteliali, muscolari e neuronali forma una matrice extracellulare continua e stratificata chiamata membrana basale. La membrana basale degenera e si rigenera durante lo sviluppo e la guarigione delle ferite. Non solo supporta le cellule e gli strati cellulari, ma svolge anche un ruolo importante nella formazione dei tessuti influenzando l'adesione cellulare, la migrazione, la proliferazione e la differenziazione, che sono funzioni della membrana basale. Pertanto, si può affermare che la membrana basale è la principale barriera all'invasione delle cellule tumorali metastatiche.

Figura 1. La matrice della membrana basale Ceturegel™

La matrice della membrana basale Ceturegel™ sviluppata e prodotta da YEASEN non contiene LDEV (Lactate Dehydrogenase Enhancing Virus) e ha un contenuto di endotossine ultra-basso. E dopo il rilevamento del micoplasma per garantire l'assenza di contaminazione da micoplasma, inclusi diversi tipi come concentrazione di base, alta concentrazione e basso fattore di crescita.

2. Qual è il ruolo della matrice della membrana basale Ceturegel™?

La matrice della membrana basale Ceturegel™ può essere utilizzata per preparare matrici della membrana basale di vari requisiti. Può essere utilizzata per studi sulla segnalazione cellulare, come lo studio del ruolo dei fattori di crescita nella formazione dei tubuli renali da parte delle cellule staminali renali di topo, lo studio dell'espressione genica delle cellule staminali epiteliali mammarie di topo e l'esperimento di invasività tumorale di Transwell. Allo stesso tempo, può essere utilizzata per lo studio della morfologia cellulare, della funzione biochimica, della migrazione, dell'infezione e dell'espressione genica. La matrice della membrana basale Ceturegel™ può aiutare efficacemente l'attaccamento e la differenziazione delle cellule epiteliali e di altri tipi di cellule, tra cui cellule nervose, cellule staminali, cellule epiteliali di mammifero, cellule di melanoma, cellule endoteliali vascolari, cellule tiroidee e cellule del follicolo pilifero. Allo stesso tempo, la matrice della membrana basale Ceturegel™ influenza anche il livello di espressione proteica delle cellule epiteliali mammarie murine e supporta la rigenerazione dei nervi periferici.

Figura 2.Le principali direzioni di applicazione della matrice della membrana basale Ceturegel™

Migrazione e invasione cellulare in dettaglio: la migrazione cellulare, nota anche come strisciamento cellulare, movimento o movimento, si riferisce al movimento delle cellule dopo aver ricevuto un segnale di migrazione o aver percepito un gradiente di determinate sostanze. La migrazione cellulare è un processo alternato di estensione degli pseudopodi nella testa cellulare, creazione di nuove aderenze e retrazione della coda del corpo cellulare. La migrazione cellulare è una delle funzioni di base delle cellule normali ed è anche un processo fisiologico di normale crescita e sviluppo del corpo. Come forma onnipresente di movimento delle cellule viventi, può partecipare a una varietà di processi fisiologici e patologici collettivi. Come sviluppo embrionale, angiogenesi, guarigione delle ferite, risposta immunitaria, risposta infiammatoria, aterosclerosi, metastasi del cancro, ecc. Mentre l'invasione cellulare si riferisce alla capacità delle cellule di migrare da un'area all'altra attraverso la matrice extracellulare. L'invasione cellulare è la risposta delle cellule normali e delle cellule cancerose a stimoli chimici e meccanici. L'invasione cellulare si verifica spesso nei processi di guarigione delle ferite, angiogenesi, infiammazione, metastasi delle cellule tumorali e infiltrazione anomala dei tessuti.

3. Quali sono le caratteristiche della matrice della membrana basale Ceturegel™?

Alta sicurezza: no LDEV (virus con aumento della lattato deidrogenasi)
Diversità di concentrazione: l'intervallo di concentrazione è compreso tra 8~20 mg/ml
Buona stabilità del lotto: rigoroso processo di controllo della qualità della produzione per garantire prestazioni stabili tra i lotti
Bassa endotossina: contenuto di endotossina <8 EU/ml
Rilevamento della contaminazione: non sono stati rilevati residui di micoplasmi, batteri e funghi
Elevata produzione di lotti singoli: la produzione di un singolo lotto è superiore al livello di 50L
Compatibilità: Compatibile con qualsiasi tipo di terreno di coltura cellulare

4. L'applicazione popolare della matrice della membrana basale Ceturegel™

4.1 Saggio di migrazione e invasione

Il metodo sperimentale per rilevare la capacità di migrazione e invasione delle cellule è l'esperimento Transwell, chiamato anche esperimento di perforazione. La sospensione cellulare viene aggiunta prima alla camera perché la camera ha pori densi. Le camere sono state quindi posizionate in una piastra a 24 pozzetti a cui è stato aggiunto un mezzo completo. Le cellule si sono deformate e sono passate attraverso i fori nella camera verso l'esterno della camera più ricca di nutrienti, dove si sono attaccate all'esterno. Colorando e contando le cellule all'esterno della camera, è possibile valutare la capacità di migrazione e invasione delle cellule. Il principio di Transwell è quello di mettere la piccola camera nella piastra di coltura, la piccola camera è chiamata camera superiore e la piastra di coltura è chiamata camera inferiore. Gli strati superiore e inferiore del fluido di coltura sono separati da una membrana in policarbonato, lo strato superiore del fluido di coltura viene aggiunto alla camera superiore e lo strato inferiore del fluido di coltura viene aggiunto alla camera inferiore. Le cellule si trovano nella camera superiore e la composizione del mezzo inferiore influenzerà le cellule nella camera superiore a causa della permeabilità della membrana. Inoltre, sono stati studiati gli effetti dei componenti nel mezzo inferiore sulla crescita e sul movimento delle cellule.
Operazioni specifiche della matrice della membrana basale Ceturegel™ nei test di migrazione e invasione: la matrice della membrana basale Ceturegel™ diluita è stata aggiunta alla camera superiore del Transwell e le cellule sono state piastrate e incubate in un ambiente a 37°C, 5% di CO₂ incubatore per 24 ore, fissato in paraformaldeide al 4% e colorato con soluzione colorante al violetto di cristallo allo 0,1%. Le cellule sono state osservate e contate al microscopio a contrasto di fase invertito.

Figura 3. Risultati della colorazione con violetto di cristallo dopo l'invasione cellulare

4.2 Angiogenesi

1) Un giorno prima dell'esperimento, togliere il Ceturegel™ Togliere il Matrigel dal congelatore e riporlo in frigorifero a 4°C durante la notte per farlo scongelare, preraffreddando nel contempo i materiali di consumo utilizzati.
2) Conservare sempre Ceturegel™ Matrigel in una ghiacciaia prima dell'esperimento. Aprire la confezione sterile dei vetrini angiogenici e rimuovere i vetrini.
3) Aggiungere 10 μl di Ceturegel™ Matrigel in ogni pozzetto. Notare che la punta della pipetta deve essere perpendicolare alla parte superiore del foro interno quando si aggiunge Ceturegel™ Matrigel per evitare che il Matrigel scorra attraverso il foro superiore e lasci un residuo di colla.
4) Per prima cosa coprite il vetrino, preparate una capsula di Petri da 10 cm e metteteci sopra della carta assorbente imbevuta d'acqua per creare una scatola umida.
5) Mettere i vetrini nella capsula di Petri e coprire la capsula di Petri. Metterla in una CO₂ incubatrice, lasciare riposare per circa 30 minuti, attendere che il gel coaguli e preparare contemporaneamente la sospensione cellulare.
6) Preparare le cellule digerite in una sospensione cellulare con una densità di 2*10⁵ cellule/ml e mescolare accuratamente.
7) Rimuovere il vetrino contenente il vaso sanguigno che si è solidificato in un gel. Aggiungere 50 μl di sospensione cellulare a ciascun pozzetto, facendo attenzione a mantenere la punta della pipetta verticalmente sopra il pozzetto superiore e a non toccare il gel nel pozzetto inferiore.
8) Aggiungere il terreno di coltura cellulare, chiudere il coperchio e lasciare riposare. Dopo un po' di tempo, tutte le cellule affonderanno sulla superficie del Matrigel.

Figura 4. Grafico dei risultati dell'angiogenesi

Colorazione immunofluorescente

1) Rimuovere con attenzione il terreno dai pozzetti senza toccare la colla o la rete cellulare. Diluire la calceina nel terreno privo di siero fino a una concentrazione finale di 6–8 µg/ml. Aggiungere la soluzione colorante cellulare per immergere completamente le cellule e incubare a temperatura ambiente per 30-40 minuti al buio.
2) Lavare tre volte con PBS. Notare che il PBS deve essere aggiunto lentamente ai pozzetti superiori per evitare di impattare sulle cellule. Osservazione della fluorescenza utilizzando Ex=485 nm, Em=529 nm di lunghezza d'onda

Figura 5. Colorazione immunofluorescente dei vasi sanguigni

4.3 Coltura cellulare 3D

A differenza della coltura cellulare tradizionale, la coltura cellulare 3D riproduce l'ambiente in vivo delle cellule. Anche i semplici modelli sferoidi possono compensare le carenze delle colture monostrato. Queste strutture possono formare gradienti di ossigeno, nutrienti, metaboliti e segnali solubili, che a loro volta formano diverse popolazioni cellulari. La tecnologia della coltura cellulare 3D può simulare meglio l'ambiente naturale in cui le cellule vivono negli organismi, rendendo più realistiche le interazioni tra cellule e risposte biochimiche e fisiologiche. In un ambiente 3D, le risposte delle cellule agli stimoli endogeni ed esogeni assomigliano più da vicino alle loro risposte in vivo.
Il funzionamento specifico della matrice della membrana basale Ceturegel™ nella coltura cellulare 3D è il seguente: mescolare delicatamente la matrice della membrana basale Ceturegel™ con la concentrazione regolata di sospensione monocellulare HepG2 1:1 e aggiungere 50 μl della sospensione monocellulare miscelata sopra alla piastra a 24 pozzetti preraffreddata con una punta di pipetta preraffreddata per formare goccioline cellulari a forma di arco coltivate in un incubatore a 37°C, 5% di CO2, osservate e fotografate ogni giorno.

Figura 6. Risultati della coltura cellulare 3D

Tabella 1. Riferimento d'uso della matrice della membrana basale di Ceturegel™ per colture cellulari 3D:

Nota: diversi lotti di matrice della membrana basale Ceturegel™ presentano una certa differenza di concentrazione, il dosaggio raccomandato è solo di riferimento

4.4 Esperimento di formazione tumorale in vivo

Prendendo come esempio l'esperimento di tumorigenesi sottocutanea delle cellule HepG2 nei topi nudi, la matrice della membrana basale Ceturegel™ e la sospensione cellulare sono state utilizzate per una diluizione 1:1 e topi femmina BALB/c-nu di età compresa tra 4 e 5 settimane sono stati inoculati per via sottocutanea. Il processo sperimentale è il seguente:
♦ Preparare le cellule HepG2 con crescita logaritmica e densità cellulare pari a circa l'80-90% e cambiare il terreno di coltura fresco la sera prima di raccogliere le cellule.
♦ Le cellule vengono digerite dalla tripsina. Quando le cellule diventano rotonde e non lasciano la piastra di coltura, la tripsina viene rimossa, il mezzo privo di siero viene aggiunto per creare la sospensione cellulare, centrifugata e pulita una volta e la concentrazione finale è 5 × 10⁷ cellule/mL.
♦ Diluire la sospensione cellulare e la matrice della membrana basale Ceturegel™ in rapporto 1:1 a 4 ℃ per preparare una concentrazione finale di 5 × 10⁷ cellule/mL.
♦ Afferrare un topo nudo fisso con la mano sinistra e iniettarlo sottocutaneamente nella spalla destra del topo nudo. Durante l'inoculazione, l'ago viene inserito sottocutaneamente un po' più in profondità, circa 1 cm di profondità, per ridurre il traboccamento di sospensione cellulare dalla cruna dell'ago dopo l'iniezione.
Il volume di inoculazione è di 200 μ L. (Questo processo dovrebbe essere completato entro mezz'ora, per quanto possibile. Durante il percorso, la sospensione cellulare dovrebbe essere posta su ghiaccio per rallentare l'apoptosi cellulare e prevenire il fenomeno del gel).
♦ Rimettendo i topi nudi nella gabbia per continuare a nutrirsi, il tumore rimarrà visibile per circa 1 settimana/1 mese.Secondo il progetto sperimentale, i topi nudi vengono soppressi quando il volume del tumore raggiunge i requisiti e vengono scattate delle foto.

Nota: il gruppo di controllo è costituito dalla sospensione del terreno di coltura e delle cellule e la densità finale è la stessa del gruppo di prova della colla a matrice.

4.5 Coltura organoide

Gli organoidi sono minuscoli tessuti multicellulari 3D differenziati dalle cellule staminali. Alcune proprietà degli organi possono essere riprodotte. Gli organoidi sono multicellulari e mostrano un alto grado di autoassemblaggio, e sono quindi più in grado di mostrare complesse risposte e interazioni cellulari in vivo rispetto alle tradizionali colture 2D. Le cellule staminali e/o le cellule progenitrici degli organi da tessuti normali o malati possono essere mescolate con matrice di membrana basale Ceturegel™ o collagene. Formano reni, tiroide, fegato, cervello, polmoni, intestino, prostata e altri microorgani. Ad esempio, per i ricercatori che conducono screening genetici, i substrati di matrice di membrana basale Ceturegel™ possono essere utilizzati come bioinchiostri per consentire la localizzazione precisa e l'inclusione di cellule viventi/organoidi nella biostampa 3D.

Figura 7. Processo operativo dell'organoide

Costruzione di organoidi dell'intestino tenue del topo

Preparazione del campione: i topi sono stati uccisi tagliando loro il collo e la superficie è stata spruzzata con alcol per la sterilizzazione. Tagliare il tessuto intestinale di 3~15 cm vicino all'estremità gastrica sotto l'ambiente sterile, rimuovere con attenzione il mesentere e il grasso all'esterno del tratto intestinale con delle pinzette e metterlo nella soluzione DPBS contenente l'1% di doppio anticorpo preraffreddato a 4 ℃.

Pulizia del campione: utilizzare una siringa per lavare il tratto intestinale 2-3 volte, utilizzare delle forbici chirurgiche per tagliare con attenzione il tratto intestinale con la cavità intestinale rivolta verso l'alto e utilizzare una lama chirurgica per raschiare delicatamente i villi intestinali sulla superficie della cavità intestinale e, dopo aver raschiato i villi intestinali (mostrando tessuto trasparente), posizionare il tessuto intestinale in una nuova piastra di coltura contenente DPBS per 2-3 volte.

Trattamento iniziale dei campioni: tagliare il tessuto intestinale tenue lavato in piccoli pezzi larghi 2 mm, quindi trasferirli in una nuova provetta da centrifuga da 50 ml. Lavarli delicatamente 3-5 volte con DPBS per rimuovere le cellule dei villi intestinali e il tessuto adiposo galleggiante.

Digestione del campione: aggiungere 10-15 ml di DPBS preraffreddato contenente 3-5 mM di EDTA ai frammenti di intestino tenue puliti per la digestione, incubare a 4 ℃ per circa 30 minuti e agitare delicatamente la provetta da centrifuga ogni 10 minuti durante questo periodo.

Dopo la digestione, eliminare il surnatante della soluzione di digestione con EDTA e sciacquare delicatamente i tessuti con una nuova soluzione tampone DPBS 2-3 volte per rimuovere l'EDTA rimanente.

Aggiungere 10-15 ml di DPBS preraffreddato contenente lo 0,1% di BSA nei frammenti di tessuto dell'intestino tenue, soffiare e risospendere ripetutamente i frammenti di tessuto per separare la cavità dallo strato basale, quindi prelevare una piccola sospensione per l'esame microscopico. Quando si osserva un gran numero di strutture simili a cavità, smettere di soffiare e utilizzare il 70% per la sospensione di tessuto soffiata μM Filtro a rete per filtrare e raccogliere la sospensione di tessuto che passa attraverso il filtro a rete.

Ripetere i passaggi 5-6 due volte e centrifugare a 1500 giri/min e 4 ℃ per 3 minuti.

Formazione della miscela: Ceturegel™ Matrix glue sospensione pesante recesso precipitazione tissutale, ogni 10 μL di matrix glue suspension contiene 200~600 recessi. Dopo la risospensione, la miscela viene posta su ghiaccio e utilizzata il prima possibile per evitare che la matrix glue formi gel.
Nota: rapporto di diluizione della colla della matrice ≥ 50% per garantire la stabilità della struttura adesiva della matrice durante il processo di coltura di Ceturegel™.

Piantare la sospensione mista al centro del fondo della piastra da 24 pozzetti, 30~50 μL per pozzetto a sinistra e a destra, per evitare che la sospensione entri in contatto con la parete laterale della piastra forata.

Collocare la piastra di coltura coltivata nell'incubatrice a temperatura costante di anidride carbonica a 37 ℃ e incubarla per circa 30 minuti, finché il gel della matrice non si solidifica.

Attendere Ceturegel™ Dopo che la matrice adesiva si è completamente solidificata, aggiungere lentamente il terreno di coltura degli organi intestinali preparato lungo la parete, 800 μL per pozzetto.

Mettere la piastra a 24 pozzetti nell'incubatrice a anidride carbonica a 37 ℃ per la coltura. Sostituire il terreno fresco ogni 3 giorni e monitorare lo stato di crescita di un organo come gli organi. In genere, l'organo come gli organi dell'intestino tenue dei topi si forma entro 5-7 giorni.

Figura 8. Risultati della coltura in vitro di organi simili all'intestino tenue del topo

5. Domande frequenti

1. Qual è la ragione della differenza di colore (da giallo chiaro a rosso scuro) del substrato ottenuto?
Per la matrice della membrana basale Ceturegel™ contenente rosso fenolo, ciò è causato principalmente dall'interazione del rosso fenolo e del bicarbonato con CO₂, ma la differenza di colore sarà ridotta dopo l'equilibratura con il 5% di CO₂Dopo il congelamento e lo scongelamento, agitare delicatamente la fiala per disperdere uniformemente la matrice della membrana basale di Ceturegel™.
2. A quali aspetti bisogna prestare attenzione nel funzionamento della matrice della membrana basale Ceturegel™?
Tutte le operazioni devono essere eseguite in un ambiente sterile e deve essere utilizzata una pipetta preraffreddata per garantire l'omogeneizzazione della matrice della membrana basale Ceturegel™.
3. Come congelare e conservare la matrice della membrana basale Ceturegel™ per l'uso?
La matrice della membrana basale Ceturegel™ Matrix LDEV-Free Ceturegel™ congelata e scongelata può essere distribuita in più piccole provette. Tutte le distribuzioni devono essere in crioprovette pre-raffreddate, che devono essere rapidamente congelate e conservate per evitare congelamenti e scongelamenti multipli. Tutti gli articoli coinvolti devono essere pre-raffreddati prima dell'uso. Utilizzare pipette, puntali e piccole provette pre-raffreddate per maneggiare la matrice della membrana basale Ceturegel™.

6. La guida alla selezione della matrice della membrana basale Ceturegel™ di Yeasen

Diversi tipi di matrice di membrana basale Ceturegel™ hanno diverse applicazioni. Concentrazioni standard di matrice di membrana basale Ceturegel™ possono essere utilizzate per colture di cellule polari, come le cellule epiteliali. Può promuovere la differenziazione di varie cellule ed essere utilizzata per esperimenti di migrazione e invasione delle cellule tumorali. Alte concentrazioni di matrice di membrana basale Ceturegel™ sono ampiamente utilizzate in vivo e possono essere utilizzate per esperimenti di formazione di tubuli. La funzione principale del fattore di crescita basso (GFR) è quella di eliminare l'interferenza dei fattori di crescita nell'esperimento ed è adatta per studi con elevati requisiti per la preparazione della membrana basale. La matrice di membrana basale Ceturegel™ senza rosso fenolo può eliminare l'interferenza dell'indicatore rosso fenolo ed è adatta per esperimenti di sviluppo del colore, come colorimetria e rilevamento della fluorescenza. La matrice di membrana basale Ceturegel™ di grado per coltura di cellule staminali embrionali umane è utilizzata appositamente per la coltura di cellule staminali embrionali umane, coltura di cellule staminali pluripotenti indotte senza feeder. Yeasen fornisce molti tipi di matrice di membrana basale Ceturegel™, puoi sceglierli in base ai tuoi esperimenti.

Tabella 2. Guida alla selezione della matrice Ceturegel™

Tipo di prodotto	Numero di gatto.	Nome del prodotto	Matrigel Cat. n.	Direzione dell'applicazione
Concentrazione basica (8-12 mg/ml)	40183ES	Ceturegel™Matrix senza LDEV	356234/ 354234	Si adattano a esperimenti di coltura, invasione e migrazione 2D e 3D e possono essere utilizzati anche per esperimenti tumorigenici in vivo
	40184ES	Ceturegel™Matrix Senza fenolo rosso, senza LDEV	356237	Utilizzato principalmente per il rilevamento del colore, come esperimenti di rilevamento della fluorescenza, ecc.
Riduzione del fattore di crescita	40185ES	Ceturegel™Matrix GFR, senza LDEV	354230	Principalmente per escludere l'interferenza dei fattori di crescita sull'esperimento. Applicato alla ricerca correlata sui fattori di crescita, vie di segnalazione, ecc.
	40186ES	Ceturegel™Matrix GFR, senza rosso fenolo, senza LDEV	356231
Alta concentrazione (≥18mg/ml)	40187ES	Ceturegel™Matrix ad alta concentrazione, senza LDEV	354248	Utilizzato principalmente in esperimenti quali angiogenesi, embolizzazione del gel e formazione di tumori in vivo (per l'angiogenesi, si raccomanda che la concentrazione finale della matrice della membrana basale di Ceturegel™ sia ≥10 mg/ml)
	40189ES (inchiesta)	Ceturegel™Matrix ad alta concentrazione, GFR, senza LDEV	354263
	40188ES	Ceturegel™Matrix ad alta concentrazione, senza rosso fenolo, senza LDEV	354262
Per le cellule staminali	40190ES	Ceturegel™Matrix hESC-qualificato, LDEV-free	354277	Utilizzato principalmente per la coltura di cellule staminali come hESC, iPSC, ecc.
Specifico dell'organoide	40191ES (inchiesta)	Matrice Ceturegel™ per coltura organoide, priva di rosso fenolo, priva di LDEV	356255	Matrice della membrana basale Ceturegel™ per la coltura di organoidi