ヌードマウスの腫瘍の成長をリアルタイムで制御したいですか? マウスの細胞コロニー化の位置を知りたいですか?生体内での腫瘍に対する薬物治療の効果を知りたいですか? これらは、細胞にトラッカーをインストールすることで実現でき、いつでも細胞の位置と数を制御できます。この技術は、生体内イメージング「検出」技術です。では、生体内イメージング技術とは何でしょうか?

1. 生体内イメージング技術とは何ですか?
2. ルシフェラーゼイメージングの特徴
3. ルシフェラーゼイメージングの応用方向
4. 実験例の共有
5. よくある質問
6. 製品情報
7. 読書について

1. 生体内イメージング技術とは何ですか?

1999年、米国ハーバード大学のワイスレーダー博士は、分子イメージングの概念を提唱しました。これは、イメージング法を使用して、生体内の生物学的プロセスを細胞レベルと分子レベルで定性的および定量的に研究するというものです。生体内イメージングは​​分子イメージングに基づいています。このイメージングシステムを通じて、腫瘍の成長と転移、感染症の発症、特定の遺伝子の発現などの生物学的プロセスを生きた動物で観察できます。

生体内では、生きた動物の光学イメージングは​​主に生物発光と蛍光の2つの技術を採用しています。生物発光はルシフェラーゼ遺伝子で細胞やDNAにマーキングする技術で、蛍光技術は緑色蛍光タンパク質や赤色蛍光タンパク質などの蛍光レポーター遺伝子とFITC、Cy5、Cy7などの蛍光元素や量子ドット（QD）で標識します。哺乳類の生物発光は、一般的にホタルルシフェラーゼ遺伝子（554ヌクレオチド、約50KDで構成）、つまりルシフェラーゼ遺伝子を、予想される観察細胞の染色体DNAに組み込んでルシフェラーゼを発現させます。次に、ルシフェラーゼを安定的に発現できる細胞株を培養し、細胞が分裂、分化、転移すると、ルシフェラーゼも安定して発現し続けます。遺伝子、細胞、生きた動物はすべてルシフェラーゼ遺伝子でタグ付けできます。ルシフェラーゼは、基質を触媒して生物発光を生み出すことができる一種の酵素です。異なる起源のルシフェラーゼはそれぞれ特徴があり、基質を触媒して異なる色の光を発することができます。その中でも、ホタルルシフェラーゼは感度が高く、7〜8桁の広い線形範囲を持っています。これは、最も一般的に使用される哺乳類細胞レポーター遺伝子となっています。ルシフェラーゼレポータープラスミドを細胞に導入し、その基質ルシフェリンを加えて細胞をインキュベートします。ATP、O ₂ 、マグネシウムイオンの存在下で、ルシフェラーゼはルシフェリン基質を酸化して可視光反応を起こすことができます。「一度の「トラッカー」のインストールで、いつでも追跡・検出」を実現します。ホタルルシフェラーゼに加えて、ウミシイタケルシフェラーゼが使用されることもあります。両者の基質は異なり、前者の基質はD-ルシフェリン、後者の基質はセレンテラジンです。両者の発光波長は異なり、前者が発する光波長の範囲は540〜600nmで、後者が発する光波長の範囲は460〜540nmです。前者が発する光は組織を通過しやすいのに対し、後者は体内で代謝が速く、特異性は前者ほど良くありません。そのため、ホタルルシフェラーゼをレポーター遺伝子として使用する生体内実験はほとんど行われていません。

図1. ルシフェラーゼ標識細胞の局在

生物発光の光学原理：光は哺乳類の組織内を伝播する際に散乱・吸収され、光子は細胞膜や細胞質に遭遇する際に屈折し、細胞や組織の種類によって光子吸収特性が異なります。ヘモグロビンは体内の可視光吸収の主な原因であり、可視光の青緑帯域の大部分を吸収できます。しかし、600nmを超える可視光の赤色帯域では、ヘモグロビンの吸収は非常に小さいです。そのため、大量の光が組織や皮膚を通過して赤みがかった領域で検出されます。生きた動物の生物発光イメージング技術を使用すると、少なくとも数百個の皮下細胞を検出できます。ただし、マウス内の光源の深さに応じて、見える細胞の最小数は異なります。一般的に、1cm増加するごとに光度は10倍減衰し、血液が豊富な組織や臓器では減衰が大きく、骨に隣接する組織や臓器では減衰が小さくなります。同じ深さの場合、検出された光度は細胞数と顕著な線形関係があり、検出された光度は機器によって定量化され、細胞数を反映することができます。

図2. ルシフェラーゼとルシフェリンカリウム塩反応の発光原理

生物発光とは異なり、蛍光技術では、蛍光レポーター遺伝子または蛍光染料（蛍光量子ドットなどの新しいナノ標識材料を含む）を使用して標識します。レポーター遺伝子、蛍光タンパク質、または染料からの蛍光を使用して、生体内に生物学的光源を作成できます。生物発光は、励起光源のない動物の自己蛍光ですが、蛍光は、イメージングシステムで検出する前に外部励起光源による励起が必要です。蛍光ラベルは、動物、細胞、微生物、抗体、薬物、ナノ材料など、幅広く使用されています。

2. ルシフェラーゼイメージングの特徴

◎放射線が出ないので、生物にほとんど無害です。

◎励起光源を必要としない生物発光。

◎高感度、数百個の細胞を検出できます。

◎浸透性が良好で、3～4cmの組織深度まで検出可能です。

◎ 高い信号対雑音比、強い蛍光信号、優れた耐干渉性。

3. ルシフェラーゼイメージングの応用方向

3.1 腫瘍の増殖

ヌードマウスの腫瘍形成実験では、腫瘍の成長を侵襲なくリアルタイムで観察し、測定のために腫瘍を剥がす必要もありませんでした。

3.2 腫瘍治療薬

投与による腫瘍の増殖や転移への影響が検出され、フルオレセイン基質は薬物実験に干渉することなく 3 時間以内に除去できました。

3.3 細胞の局在

動物における外来細胞の局在と分布が検出されました。

3.4 遺伝子発現制御

標的遺伝子または標的遺伝子のプロモーターをルシフェラーゼ遺伝子と融合し、薬物治療中または疾患の経過中の遺伝子発現の変化を検出しました。

3.5 幹細胞研究

幹細胞の移植、生存、増殖をモニタリングし、生体内での幹細胞の分布と移動を追跡します。

4. 実験例の共有

図3.マウスにHN4細胞を皮下注射し、CAR-MUC1 T/CAR-MUC1-IL22 T細胞が腫瘍形成に及ぼす治療効果をin vivoイメージングで検出した^[1] 。

図4. HUC-MSCs細胞をマウス骨格筋に注入した後、生体内イメージングによって細胞の局在を検出した（赤矢印で示す） ^[2] 。

図5.生体内イメージングによる間葉系幹細胞（MSC）の火傷部位への移動の検出能力。間葉系幹細胞（MSC/FLuc）をマウスの背部火傷モデルに静脈内注射した。注射後4日で火傷創の損傷部位に生物発光シグナルが現れ、その後徐々に減少した（赤矢印は火傷部位を示す） ^[3] 。

5. よくある質問

Q1: 従来の技術と比較して、生物発光イメージング技術の利点は何ですか?

この技術は、従来の技術と比較して、腫瘍転移、遺伝子治療、疫学、幹細胞追跡、白血病などの関連研究において、より感度が高く、一連の遺伝子組み換え動物疾患モデルを通じて、関連疾患の病因と薬物スクリーニングを迅速かつ直感的に研究することもできます。

Q2: ルシフェラーゼ遺伝子で幹細胞を標識するにはどうすればいいですか?

恒常的に発現する遺伝子を標識してトランスジェニックマウスを作成し、幹細胞を標識します。造血幹細胞をマウスの骨髄から採取し、別のマウスの骨髄に移植します。この技術を使用して、体内の造血幹細胞の増殖、分化、移動を追跡できます。別の方法は、レンチウイルスで幹細胞を標識することです。

Q3: フルオレセイン注射後、どのくらいの期間検査するのが適切ですか? また、発光はどのくらい持続しますか?

一般的に、蛍光シグナルは腹腔内注射後10～15分で最も強い安定期に達し、20～30分後に減衰し始めます。3時間後にはフルオレセインが除去され、発光は完全に消えます。

Q4: マウスにフルオレセインを注入するにはどうすればいいですか? 注入方法の違いは何ですか?

フルオレセインは、腹腔内注射または尾静脈注射によってマウスに注入することができ、約1分でマウスの全身に広がります。ほとんどの場合、フルオレセインの濃度は150 mg / kgです。20 gのマウスの場合、約3 mgのフルオレセインを使用できます。腹腔内注射の場合、拡散が遅く、初期の発光が遅く、連続発光時間が長くなります。フルオレセインの尾静脈注射の場合、拡散が速く、すぐに発光し始めますが、発光の持続時間は短くなります。

6. 製品情報

Yeasenは、分子、タンパク質、細胞という3大生物学的試薬の研究、開発、生産、販売を行っているバイオテクノロジー企業です。Yeasenが提供する製品は以下の通りです。

表1. 製品情報

7. 読書について

新世代のルシフェラーゼレポーター遺伝子検出システム——より簡単、より高感度、より正確