糖尿病（DM）は、複数の疾患因子の組み合わせによって引き起こされる慢性的な高血糖を特徴とする全身性慢性代謝疾患であり、世界的な健康上の流行であり、家族の遺伝、環境因子、自己免疫に関連しています。 DMは数千年にわたって知られており、その診断と管理において大きな進歩が達成されているにもかかわらず、現在この疾患の治療法はなく、公衆衛生への影響は拡大するばかりです。したがって、DMの適切な動物モデルを確立し、DMの病因とその合併症を明らかにすることが特に重要です。一般的に使用されるDM動物モデルには、膵臓の外科的切除、化学的に誘発された糖尿病、自然発生糖尿病動物モデル、およびトランスジェニック動物などがあります。
現在、 ストレプトゾトシン（STZ）誘発糖尿病疾患モデルが広く使用されており、長期観察に適しています。STZはニトロソウレア化合物であり、体内に入ると、以下のメカニズムを通じて膵臓β細胞を特異的に破壊することができます。
（１）高用量STZを注射すると、β細胞内の細胞内補酵素I（NAD）濃度が低下し、NAD依存性のエネルギーおよびタンパク質代謝が阻害され、細胞死につながる可能性がある。
（２）STZはβ細胞の損傷に関与することが実証されている一酸化窒素（NO）の産生を増加させる。
（3）低用量のSTZを投与すると、自己免疫プロセスが誘発され、膵島のβ細胞が破壊される可能性があります。低用量のSTZによって死んだβ細胞は、抗原としてマクロファージに貪食され、Th1刺激因子を産生し、Th1型リンパ球が優位になります。その後、Th1型リンパ球はIL-2とIFN-γを産生し、膵島への炎症細胞の浸潤と、細胞を殺傷するIL-1とTNF-α、IFN-γ、NO、H 2 O 2の放出を引き起こし、最終的にDMを誘発します。
イェーセンバイオテック モデリングに高い成功率のSTZ (Cat#60256ES)を提供します: 高純度 ≥ 98% (HPLC)。
1 STZ誘発糖尿病モデル構築のための標準SOP
1.1 動物の準備
顕著な性的二形性があり、雄の方が糖尿病を発症しやすい。エストロゲンはSTZの作用を妨げるため、雌の動物は雄よりもSTZの糖尿病誘発作用に対する感受性が低い。研究によると、雌は雄よりもモデリング率が低く、死亡率が高く、特にI型ではその傾向が強い。
1 型糖尿病 (T1DM) : ラット (170-200 g) およびマウス (17-22 g) が推奨されます。1 週間の適応給餌後、動物を 12 時間絶食させ、続いて STZ を腹腔内注射します。これは操作が簡単で成功率も高いです。
2 型糖尿病 (T2DM) : ラット (4 ～ 5 週齢、体重 90 ～ 100 g、SD または Wistar など) およびマウス (4 ～ 5 週齢、体重 16 ～ 20 g、C57、ICR または Kunming など) は、STZ 投与前の 4 ～ 6 週間、高脂肪および高糖質の食事を与え、体重をそれぞれ約 240 ～ 280 g および 30 ～ 35 g まで増やします。ラットには SD、マウスには C57 が推奨されます。
1.2 STZ投与前の動物の給餌
T1DM: STZ 治療前の 1 ～ 2 週間、すべてのマウスまたはラットに標準的なげっ歯類用飼料と水を自由に摂取させ、適応給餌を行います。
T2DM: STZ 治療前に高脂肪、高糖質の食事を摂取してインスリン抵抗性を生じさせます。
1.3 試薬の準備
①高脂肪・高糖質の食事
高脂肪・高糖質食は、基本的なラット飼料にスクロース、精製豚脂、卵黄粉を質量比で混合して作られます。割合は、豚脂 10%、スクロース 20%、卵黄粉 10%、コール酸ナトリウム 0.5%、基本飼料 59.5% です。
② STZクエン酸ナトリウム緩衝液
溶液 A および溶液 B の調製: クエン酸 (MW: 210.14) 2.1 g を量り取り、再蒸留水 100 mL に溶解して溶液 A を作成します。クエン酸ナトリウム (MW: 294.10) 2.94 g を量り取り、再蒸留水 100 mL に溶解して溶液 B を作成します。
クエン酸ナトリウム緩衝液の調製: 溶液 A と B を特定の比率 (1:1.32 または 1:1) で混合し、pH を 4.2 ～ 4.5 に調整し、0.22 μm のフィルター膜を使用して濾過滅菌します。これにより、必要なクエン酸ナトリウム緩衝液が生成されます。すぐに調製して使用することをお勧めします。
STZ 凍結乾燥粉末を量り、乾燥した滅菌ボトルに入れ、アルミホイルで包み、氷上に置きます。あらかじめ冷却したクエン酸ナトリウム緩衝液 (1% w/v) を加えて溶解し、0.22 μm のフィルター膜を使用して濾過滅菌します。
【注意】① STZ 粉末を冷蔵庫から取り出した後、完全に解凍されるまで、室温で約 10 分間光を避けて保管してください。 ② STZ は不安定なため、秤量後、STZ サンプルの入ったボトルをアルミホイルで覆い、光から保護する必要があります。 ③ 注射に熟練していない場合は、STZ を一度に溶解しないでください。操作の熟練度に応じてグループごとに STZ を溶解することをお勧めします。1 グループあたり 10 匹または 15 匹のラット/マウスなど、一度に 1 グループ分の STZ 溶液を調製します。
1.4 STZ注射
動物の空腹時の体重に応じて、腹腔内または尾静脈から注射します。腹腔内注射と比較すると、尾静脈注射は薬剤の利用効率が高いですが、技術的に困難です。注射技術が熟達していない場合は、2 つのグループに交互に注射し、30 分以内に注射を完了する必要があります。
T1DM:マウスの場合、100～200 mg/kg の単回高用量と、20～50 mg/kg の複数回低用量を 5 日間連続で投与することが推奨されます。ラットの場合、1 回の注射で 40～70 mg/kg の投与量が推奨されます。
T2DM: 1～2 か月間、高糖質、高脂肪食を与えた後、マウスの場合は 1 回あたり 70～120 mg/kg の投与が推奨され、ラットの場合は 1 回あたり 25～40 mg/kg の投与が推奨されます。
【注意】実験動物の体重、薬物耐性、絶食時間、注射方法、給餌プロセスが異なるため、STZの適切な投与量を決定するために事前実験を行うことをお勧めします。文献の投与量に従って盲目的に直接実験を行わないでください。
1.5 注射後
STZ を注射した後は、動物に水と餌を自由に与えてください。パッドは毎日交換してください。ケージは清潔で乾燥した状態に保ち、強い日光を避けてください。できるだけ頻繁に消毒してください。
【注意】STZ 注射後、動物の血糖値は、一過性高血糖（1～2 時間）、一過性低血糖（6～10 時間）、持続性高血糖（>72 時間）の 3 つの段階を示します。インスリンとグルコースを適切に供給する必要があります。
1.6 動物モデルによる救済
基準を満たさないモデルの場合、動物の状態が安定したら STZ を追加投与する（10～20 mg/kg の腹腔内注射、実際の状況に応じて適切な投与量を選択）か、血糖値が正常に戻るまで待ってから通常投与量を注射します。ただし、望ましい効果を得るには、正常状態に戻った後にモデリング プロセスを再開する必要がある場合がよくあります。
2 STZ誘発性DM動物モデルの評価
① 一般的特徴：体重減少、多飲、多食、多尿。
② 空腹時血糖値（FGB）、血清インスリン値（FINS）、経口耐糖能（OGT）、空腹時血清インスリン値（FSI）、インスリン感受性。
③血清生化学指標：T-Cho、TG、HDL-C、LDL-C、CR、BUN、Altなど
④膵臓の病理：H&E染色。
3 STZ誘発DMモデルの失敗の考えられる理由
① STZの品質が悪い。モデリング用STZの純度は98％以上（HPLC検出）でなければならない。
② STZ の分解。STZ は溶液が湿りやすいため、湿気を避けるために乾燥した状態に保つ必要があります。粉末は室温で長時間放置しないでください。溶解した STZ は非常に不安定で、中性 pH の半減期は 15 分であるため、そのまま使用する必要があります。STZ は酸性 pH 値で溶解してください。できれば氷浴で溶解してください。
③STZ溶液を腸管または他の臓器に注入した。
モデルが DM 基準を満たさない場合は、さらに 3 日間観察することをお勧めします。それでも満たさない場合は、注入手順を繰り返します。
4 STZによって引き起こされる動物の死亡率の高さの原因
① 動物が痩せている。
②飲料水の供給が不十分。
③ 高血糖または低血糖、通常は高血糖です。インスリン注射または一時的なブドウ糖補給によって緩和できます。
インスリン補充法：例えば、ノボリンNまたはNPH（中性プロタミン亜鉛インスリン）を1回につき2〜3単位投与すると、3〜5日後にはラットの一般的な死亡率が低下します。
ブドウ糖補給法：STZ注射後4時間で20％ブドウ糖を腹腔内注射すると、絶食による低血糖によるラットの死亡を回避できます。
④ 実験動物は、食料と水の供給不足により、お互いを殺し合う。
⑤ 感染。DM動物は多尿のため、他の動物よりも感染しやすく、特に尿路感染症や腹部感染症にかかりやすい。腹腔内注射、皮下注射、採血などの侵襲的手術の前後には消毒が必要である。例えば、毎回血糖値を測定した後、テトラサイクリン（またはオーレオマイシン眼軟膏）を創傷部に塗布して感染を予防する。
糖尿病モデルに影響を与える5つの要因
糖尿病疾患モデルに影響を与える要因には、STZ モデリング試薬の品質、動物の状態、投与方法などがあります。試薬の主な性能特性には、純度、安定性、溶解性などがあります。動物の状態には、主に遺伝的背景、性別、体重、飼育環境、食事構成などがあります。投与方法には、投与のタイミング、投与間隔、投与経路などがあります。差別化された要因は、差別化されたモデリング効果をもたらします。
6製品の推奨
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製品名 |
猫＃ |
仕様 |
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60256ES60 |
100mg |
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60256ES76 |
500mg |
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60256ES80 |
1グラム |
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クエン酸一水和物 |
60347ES25 |
25グラム |
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クエン酸三ナトリウム二水和物 |
60348ES25 |
25グラム |
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ストレプトゾシン STZ の溶媒 |
60750ES76 |
500mL |
[1] Xi Z, et al. 二重修飾ナノ粒子が経口インスリン送達の連続吸収障壁を克服する。J Control Release. 2022年2月;342:1-13. (PMID: 34864116, IF:7.727 )