二次抗体とは何ですか?
二次抗体は一次抗体に結合できる抗体です。主に一次抗体の存在を検出するために使用されます。一次抗体は抗原に特異的に結合し、二次抗体は一次抗体に特異的に結合します。言い換えれば、一次抗体のFc領域またはFabフラグメントは抗原として作用し、体に抗体を生成するように刺激することができます。つまり、一次抗体は主にIgGクラスの免疫グロブリンであるため、二次抗体は抗IgG抗体です。
二次抗体の役割
一次抗体は標的タンパク質に特異的に結合し、一次抗体は発光物質または発色基で標識される必要がある。一次抗体がタンパク質に結合するかどうかは肉眼では確認できない。しかし、一次抗体は比較的特異的であり、それぞれに高コストで標識されている。一次抗体に結合でき、検出可能なラベル（蛍光、放射性、化学発光、または発色基など）を持つ標識二次抗体を使用するのが一般的です。そのため、現在の設計では、一般に、一次抗体を検出するために検出可能なラベルを持つ二次抗体があり、一次抗体は基質を認識します。このようにして、一次抗体が基質に結合すると、二次抗体を介して検出できます。
たとえば、ECL 発光原理: ECL 基質には H 2 O 2とルミノール (およびその誘導体) が含まれており、HRP (ホースラディッシュペルオキシダーゼ) の作用により蛍光を発します。
二次抗体を使用する際のポイント
二次抗体は、一次抗体種（ウサギ、マウスなど）の特定のサブタイプの免疫グロブリンIgGで哺乳類（通常はヤギ、ウマ、ロバ、ラバ、モルモットなど）を免疫化することによって生成される抗体であるため、二次抗体は一次抗体の特定の種とサブタイプにのみ結合します。たとえば、ヒツジ抗マウス（二次抗体）はマウスモノクローナル（一次抗体）に特異的に結合し、ウサギポリクローナルやラットモノクローナルには結合しません。
二次抗体の結合マーク
実験方法が異なると、二次抗体の結合基も異なります。主な結合基は酵素（ホースラディッシュペルオキシダーゼ/HRP、アルカリホスファターゼ/AP）、蛍光基（FITC、ローダミン、PE、Dylight、Alexa Fluor、cy3 など）、ビオチン、金粒子などです。一般的に、WB、ELISA、IHC などの実験には HRP 標識二次抗体が推奨され、IHC にはビオチン標識二次抗体が推奨されます。一方、IF、FC などには Alexa Fluor 488、FITC、PE などの蛍光標識が使用されます。
適切な二次抗体の選び方
a. 免疫ブロット法（WB）
従来のウェスタンブロッティングの場合は、ホースラディッシュペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼで標識された二次抗体を選択します。蛍光ウェスタンブロッティングの場合は、対応する蛍光体で標識された二次抗体を選択します。
b.免疫組織化学（IHC/ICC）
B.ICC（免疫細胞化学）の場合は、ビオチンで標識された二次抗体を選択します。
C. 免疫蛍光法（IHF/ICF）
免疫沈降法では、多くの場合、Fc または Fab に特異的な二次抗体の使用を選択できます。このような二次抗体は、重鎖 (分子量 55 kDa) または軽鎖 (分子量 25 kDa) からの干渉を回避できます。
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参考文献
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