1.序文

マクロファージは、血液中の単球から分化した大型の食細胞です。ほぼすべての組織に存在し、特に皮膚、肺、腸など外界と頻繁に接触する組織に多く存在します。マクロファージは、ヒトの免疫防御、炎症反応、組織修復、免疫調節、疾患の発症など、多くの生物学的プロセスにおいて重要な役割を果たします。

一次ヒトマクロファージは組織から十分な数を分離することが難しく、培養しても増殖しません。ヒトの血液中の単球は大量に簡単に得られ、体外でマクロファージに分化できるため、単球由来マクロファージは優れた代替手段となります。

2.マクロファージの生物学的機能

貪食作用

マクロファージは、表面の受容体を介して病原体や死んだ細胞の破片を認識し、それを飲み込みます。このプロセスは、感染を除去するだけでなく、炎症やその他の問題を引き起こす可能性のあるこれらの物質が体内に蓄積するのを防ぎます。

病原体防御

マクロファージは、活性酸素や窒素酸化物などの微生物を殺す化学物質や、炎症反応を制御するサイトカインやケモカインを生成して病原体と戦います。

炎症の調節

マクロファージは炎症反応において複雑な役割を果たします。腫瘍壊死因子アルファ (TNF-α) やインターロイキン 1 (IL-1) などの炎症性サイトカインを放出して炎症を促進するだけでなく、IL-10 や TGF-β などの抗炎症性サイトカインを生成して炎症を抑制することもできます。

組織の修復と再建

炎症反応の後、マクロファージはさまざまな成長因子を分泌して組織の修復と再生を助けます。マクロファージは損傷の残骸を除去しながら、新しい組織の形成を促進します。

免疫調節

マクロファージは、T 細胞に抗原を提示することで特定の免疫反応を促進します。同時に、T 細胞や B 細胞の活動の調節など、さまざまなサイトカインを分泌して免疫システムの他の構成要素を調節します。

病気との関係

マクロファージは、感染症、自己免疫疾患、腫瘍、動脈硬化症などの慢性炎症性疾患など、多くの疾患の発症に重要な役割を果たします。

3. マクロファージの分類

マクロファージは、その活性化状態と機能に応じて、M1 と M2 の 2 つの主要なカテゴリに分類できます。これら 2 つのサブタイプは、免疫応答と炎症の調節において異なる役割を果たします。

M1マクロファージ

M1マクロファージは主にインターフェロンガンマ（IFN-γ）や腫瘍壊死因子アルファ（TNF-α）などのサイトカインによって刺激され、炎症誘発性の特性を持っています。強力な抗菌活性を持ち、酸素フリーラジカルや炎症因子を生成し、細菌やウイルスなどの病原微生物の殺傷や除去に関与します。

M1 マクロファージは、体の免疫防御と炎症反応に関与し、炎症細胞と免疫細胞の浸潤を促進し、感染した組織や損傷した組織の除去を助け、免疫炎症反応の発生と維持を促進します。

M2マクロファージ

M2 マクロファージは主にインターロイキン 4 (IL-4) やインターロイキン 13 (IL-13) などのサイトカインによって刺激され、抗炎症および修復特性を持ちます。組織の修復および再生プロセスに関与し、抗炎症反応と免疫調節を促進します。

M2 マクロファージは炎症および組織修復の後期段階で重要な役割を果たし、炎症の解決および組織修復を促進し、免疫反応のバランスを調節し、組織の再生および修復を促進します。

図1.活性化マクロファージの主なマクロファージ分極状態のまとめ^[1]

4.マクロファージの分離、培養、分化

4.1 分離方法

末梢血からの分離

単球の分離: 末梢血単核細胞 (PBMC) は、密度勾配遠心分離法 (例: Ficoll-Paque) を使用して分離されます。血液サンプルを Ficoll の上層に加え、遠心分離後、単球は血漿層と Ficoll 層の間に配置されます。

マクロファージの分離: 単球を PBMC から分離した後、プラスチック接着によって単核前駆細胞をさらに分離できます。単球をプラスチック培養皿で数時間培養し、非接着細胞を除去します。残った接着細胞は主に単核前駆細胞です。

組織からの分離

組織サンプルは、機械的処理および/または酵素処理（コラーゲナーゼや DNase など）によって単細胞懸濁液に分解されます。非標的細胞は密度勾配遠心分離またはネガティブ選択（抗体および磁気ビーズを使用）によって除去され、マクロファージが収集されます。

4.2 培養方法

一般的に使用される培養培地にはRPMI 1640またはIMDMがあり、通常は10%のウシ胎児血清（FBS）、1%のペニシリン/ストレプトマイシン、および必要な成長因子を補充する必要があります。培養条件は通常、インキュベーター内で37°C、5% CO2で行われます。

4.3 分化誘導法

単核前駆細胞からの分化

M-CSF の使用:マクロファージコロニー刺激因子 (M-CSF) を通常 20 ～ 50 ng/mL の濃度で培養培地に加え、7 ～ 10 日間培養を継続して単核前駆細胞のマクロファージへの分化を誘導します。

GM-CSF の使用:顆粒球マクロファージコロニー刺激因子 (GM-CSF) は、マクロファージの分化、特に M1 (炎症誘発性) マクロファージを生成する傾向を誘発することもできます。

表現型と機能のさらなる制御

M1 マクロファージ:培養培地に IFN-γ (インターフェロン-γ) と LPS (リポ多糖) を添加することで誘導できます。

M2 マクロファージ: IL-4 や IL-13 などの抗炎症性サイトカインを添加することで誘導できます。

これらの方法により、研究者はマクロファージのさまざまな生物学的機能と、in vitro での病的条件下でのマクロファージの挙動を研究することができます。各ステップの特定の操作条件 (細胞密度、培養時間、添加因子の濃度など) は、実験の特定の目的に応じて最適化する必要がある場合があります。

表1. マクロファージ培養および誘導条件

セルソース	培養培地	初期追加	M1偏向	M2偏向
THP-1セル	1640 型	100 ng/mL PMA	20 ng/mL IFN-γ 100 ng/mL リポ多糖	20 ng/mL IL-4 20 ng/mL IL-13
単球	RPMI1640	M1:50 ng/mL GM-CSF M2: 50 ng/mL M-CSF	10 ng/mL LPS 50 ng/mL IFN-γ	M2a: 20 ng/mL IL-4 M2b: IgG+LPS M2c: 20 ng/mL TGF-β1 または 10 ng/mL IL-10
M矢印	IMDM	10～50 ng/mL M-CSF	100 ng/mL リポ多糖（50ng/mL IFN-γを添加可能）	10 ng/mL IL-4 (10 ng/mL IL-13 添加可能)
RAW264.7 セル	DMEM	/	100 ng/mL リポ多糖	20 ng/mL IL-4 (20 ng/mL IL-10添加可能）

5.アッセイデータ

YEASEN は、マクロファージ研究をサポートするために、マクロファージ培養に関連する HiActive® 高活性サイトカイン製品シリーズを提供しています。

HiActive® 高活性サイトカイン：各サイトカインの生物学的活性が検証されており、サイトカインの高い活性を保証します。

アクティビティ検証データ:

組み換えマウスM-CSFタンパク質

形 1 . M-NFS-60マウスを用いた細胞増殖アッセイで測定骨髄性白血病リンパ芽球細胞。この効果の ED50 は通常 16.74 -25.83 ng/ml です。

組み換えマウスGM-CSFタンパク質

図2. マウス FDC-P1 細胞を用いた細胞増殖アッセイで決定された ED50 は 2.79 ～ 12.84 pg/mL です。

組み換えヒトIL-10タンパク質

図3マウスMC/9細胞を用いた細胞増殖アッセイで決定されたED50は0.1 ng/mL未満であり、これは1.0×10 ⁷ IU/mgを超える比活性に相当します。

分類	種	猫	仕様
G-CSF	人間	91101ES	2μg/10μg/50μg/100μg
G-CSF	ねずみ	91107ES	2μg/10μg/50μg/100μg/500μg
マクロファージ	人間	91103ES	10μg/100μg/500μg
マクロファージ	ねずみ	91114ES	10μg/100μg/500μg
GM-CSF	人間	91102ES	5μg/50μg/100μg/500μg
GM-CSF	ねずみ	91108ES	10μg / 100μg / 500μg
インターフェロン-γ	人間	91204ES	20μg/50μg/100μg/500μg
インターフェロン-γ	ねずみ	91212ES	5μg/50μg/100μg/500μg
IL-4	人間	90105ES	5μg/50μg/100μg/500μg
IL-4	ねずみ	90144ES	5μg/100μg/500μg
IL-10	人間	90109ES	2μg/10μg/50μg/100μg/500μg
IL-10	ねずみ	90149ES	2μg/10μg/50μg/100μg/500μg
IL-13	人間	90112ES	2μg/10μg/50μg/100μg/500μg
IL-13	ねずみ	90151ES	2μg/10μg/50μg/100μg/500μg

マクロファージ分極培養：サイトカインの役割