1.ラミニン521の背景
ラミニン 521 (LN521) は、天然の幹細胞ニッチにおける重要な細胞接着タンパク質であり、ヒト胚性幹細胞 (hES) および人工多能性幹細胞 (hiPSC) の培養と増殖のためのマトリックスです。LN521 は細胞表面受容体に結合し、細胞シグナル伝達経路を活性化して、より機能的な細胞の生成をもたらします。
ラミニン521は、生体外で生物学的に関連するhPSC環境を再現し、hPSCの付着、高い生存率、強力な長期自己複製を促進し、幹細胞の成長をサポートし、基底膜構造と性能の安定性を維持する重要なマトリックスタンパク質です。ラミニン521は、最も一般的に使用されている無栄養培養マトリックスの1つでもあります。さらに、ラミニン521は、アポトーシス抑制剤を添加することなく、遺伝的に安定した多能性幹細胞の効率的な単細胞継代を実現できます。細胞は均一な単層で成長し、分化領域を手動で除去する必要はありません。さらに、研究によると、LN521は核型異常の兆候なしに10世代以上にわたってPSCの成長をサポートし、PSCが内胚葉、中胚葉、外胚葉の3つの胚葉に分化する能力を維持できることが示されています。
図1. ラミニン521の構造[1]
2.ラミニンコーティング実験
2.1 滅菌脱イオン水または注射用水でラミニン 521 を 400µg/ml に調製します。使用前に滅菌 1×DPBS (Ca++/Mg++) でさらに 100µg/ml に希釈し、次に滅菌 DPBS (Ca++/Mg++) で 5～10µg/ml の作業濃度に希釈することをお勧めします。コーティング濃度は培養細胞の種類によって異なるため、実験プロトコルを最適化して細胞に最適なコーティング濃度を決定することをお勧めします。推奨濃度については表 1 を参照してください。
注意:二価カチオンがタンパク質の構造と機能に重要なので、Ca 2+と Mg 2+を含む DPBS を使用する必要があります。ラミニン 521 の必要な作業濃度は、細胞と用途によって異なります。初期コーティング濃度は 0.5μg/cm 2をお勧めします。
表 1. さまざまな培養容器に対する組換えヒトラミニン作業溶液の推奨量。
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ペトリ皿 |
コーティング濃度（μg/mL） |
LN521の添加量 |
1*DPBSの添加量 |
総量 |
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6 井戸 |
5 |
50μL/ウェル |
950μL/ウェル |
1mL/ウェル |
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12 井戸 |
5 |
25μL/ウェル |
475μL/ウェル |
0.5 mL/ウェル |
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24 井戸 |
5 |
15μL/ウェル |
285μL/ウェル |
0.3 mL/ウェル |
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48 井戸 |
5 |
7.5μL/ウェル |
142.5μL/ウェル |
150μL/ウェル |
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96 ウェル |
5 |
3.5μL/ウェル |
66.5μL/ウェル |
70μL/ウェル |
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35mmペトリ皿 |
5 |
50μL/ウェル |
950μL/ウェル |
1mL/ウェル |
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60mmペトリ皿 |
5 |
100μL/ウェル |
1900 μL/ウェル |
2mL/ウェル |
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100mmペトリ皿 |
5 |
300μL/ウェル |
5700 μL/ウェル |
6mL/ウェル |
上記容量はコーティング濃度5μg/mLに基づいています。
2.2 各ウェルに指定量のラミニン-DPBS 混合物を加え、軽く振ってください。コーティングされていない表面は細胞の成長をサポートしないため、表面全体がラミニン コーティング溶液で覆われていることを確認してください。
2.3. プレートを 37°C のインキュベーターに入れて一晩インキュベートします。最小インキュベーション時間は 2 時間ですが、理想的な細胞培養条件を得るためには一晩インキュベートすることをお勧めします。培養容器が乾燥しないように注意してください。乾燥すると LN521 が不活性化されます。
2.4. 細胞を播種する準備ができたら、ラミニン 521 溶液を吸引します。
3.iPSC培養
3.1 iPSCの解凍（12ウェルプレートを例に）
3.1.1 iPSCを液体窒素またはドライアイスから取り出し、37°Cのお湯で10秒間解凍します。
3.1.2 クライオバイアルを75%アルコールで滅菌し、作業台に移します。
3.1.3 細胞を9mLのDMEM-F12が入った新しい15mL遠心チューブに移します。
3.1.4 15mL遠心管を室温で300gで5分間遠心分離します。
3.1.5 コーティングされた12ウェルプレートからラミニン溶液を捨てます。
3.1.6 細胞上清を捨て、iPSC を 1 mL の mTeSR-plus (10 µM Y-27632 を含む) に穏やかに再懸濁し、コーティングされた 12 ウェル プレートに移します。プレートを振って細胞を均等に分散させ、最終細胞密度が 1×10^5 細胞/ウェルになるようにし、室温で 10 分間放置します。培養が 4 ～ 5 日以内に継代されるようにします。
3.1.7 12ウェルプレートを37℃のインキュベーターに戻してインキュベーションします。
3.1.8 ROCK阻害剤を含む培養培地は12〜16時間後に除去し、阻害剤を含まない培地で培養を継続する必要があります。
表2. 異なる培養容器における細胞播種密度、細胞増殖速度に応じて決定された細胞数
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細胞培養容器 |
6 井戸 |
12 井戸 |
24 井戸 |
96 ウェル |
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セル番号 |
2.5~3.5×10 5 |
6～8×10 4 |
3～4×10 4 |
0.5～1×10 4 |
3.2. iPSC継代プロトコル
3.2.1 培養上清を捨て、1mLのPBS（Ca ‑‑ /Mg ‑‑ ）で洗い流します。
注意:二価陽イオンは一部の解離酵素に悪影響を及ぼすため、Ca2+ および Mg2+ を含まない PBS を使用してください。
3.2.2 PBS を捨て、0.5 mL の Gentle Cell Dissociation Reagent を加えます。室温で 6 ～ 8 分間インキュベートするか、細胞がプレートに結合しなくなるまで顕微鏡で観察します。
3.2.3 等量のDMEM-F12を加え、細胞を軽く混ぜ、室温で遠心管に移し、300gで5分間遠心分離します。
3.2.4 細胞を継代する前に、ラミニンでコーティングした12ウェルプレートを準備します。
3.2.5 上清を捨て、10µM Y-27632を含むmTeSR-plus培地に細胞を再懸濁します。
3.2.6 細胞をラミニンでコーティングした 12 ウェル プレートに移し、プレートを軽く振って細胞を均等に分散させ、室温で 10 ～ 20 分間放置します。
3.2.7 12ウェルプレートを37℃のインキュベーターに入れてインキュベートします。
注意: iPSC は単層に成長した後、急速に分化して死滅します。成長と多能性を維持するには、融合する前に継代する必要があります。
3.3. iPSCの凍結保存
3.3.1 穏やかな細胞解離試薬を準備します。
3.3.2 iPSC 継代プロトコルに従って細胞分離を実行し、細胞小器官の数を使用して凍結保存前の細胞密度を確認します。
3.3.3 各細胞チューブは、1～2×10^6の細胞密度で凍結する必要があります。iPSC継代プロトコルの遠心分離と細胞培養培地の除去の手順に従ってください。分離したiPSCペレットを適切な量の凍結保存溶液に再懸濁します。
3.3.4 再懸濁した細胞凍結保存ペレット1mLを1.5mL凍結保存チューブに加え、プログラム冷却を行った後、長期保存のために液体窒素に移します。
4.ラミニンコーティングに関する重要な注意事項
4.1. 実験プロトコルのすべてのステップは無菌条件下で実行する必要があります。
4.2. ラミニンを長時間室温にさらさないでください。
4.3. 凍結と解凍の繰り返しを避ける
4.4. 解凍後、希釈されていないタンパク質ストック溶液は滅菌条件下で2〜8℃で保存でき、少なくとも3か月間安定して保存できます。
5.関連製品情報
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製品名 |
猫＃ |
サイズ |
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92602ES |
10μg/100μg/500μg/1mg |
6.参考文献
[1]Pulido D、Briggs DC、Hua J、Hohenester E.ラミニンβ2短腕の結晶構造解析により、LFドメインがLEドメインの規則的な配列に挿入される仕組みが明らかになった。Matrix Biol. 2017年1月;57-58:204-212。