T4 DNAリガーゼについて
しかし、T4 DNA リガーゼは、安定性の低さ、アダプター間のライゲーションの多さ、DNA ライブラリの収量の低さなど、実際の応用において依然としていくつかの課題に直面しています。これらの問題は、実験効率の低下、データ品質の低下、実験結果の再現性の低さ、製品の純度の低下につながる可能性があり、それによって分子生物学実験の全体的な有効性とシーケンス データの精度に影響を及ぼします。これらの問題に対処するために、Yeasen は、子会社の Molefuture の革新的な ZymeEditor ™酵素進化プラットフォームに基づいて、T4 DNA リガーゼの酵素進化を実行しました。
図1 T4 DNAリガーゼの反応原理の模式図[1]
高性能T4 DNAリガーゼを得るための反復湿式および乾式実験スクリーニング
ATP 依存性リガーゼ酵素である T4 DNA リガーゼは、コンパクトらせん DNA 結合ドメイン (DBD)、ヌクレオチジルトランスフェラーゼ (NTase) ドメイン、および OB フォールドドメインで構成されています。Yeasen のチームは、タンパク質構造に基づいて、DNA 基質の周囲 5 ～ 20 Å の距離にわたる残基を分析し、続いて高度な計算ツールを使用して in silico スクリーニングと構造機能分析を行いました。このプロセス中に、チームはアクティブ ポケットから離れた場所にある柔軟なループを観察しました。エネルギー計算に基づいて、チームはこのループ領域で切断を設計し、ライゲーション機能に大きな影響はないものの、全体的な構造安定性に影響を与える可能性があるという仮説を立てました。さらに、チームはコンセンサス配列をアラインメントして変異体を設計し、この分析を構造機能の考慮事項と組み合わせました (下の図を参照)。
図2 T4 DNAリガーゼの構造
合理的設計に加えて、安定性、活性、残留活性をスクリーニングすることにより、MTPS法でT4 DNAリガーゼの指向性進化を実施しました。そして、10 4を超える変異体のライブラリーをスクリーニングしました。変異データを徹底的に分析した後、有望な候補を選択して精製と厳格なテストを行いました。次に、合理的設計と指向性進化によって得られたすべての勝者は、精製後の詳細な特性評価を受け、活性、安定性、アダプター自己連結、DNA断片自己連結、DNA収量などの評価を行いました。チームはG1変異体に基づいてDNAシャッフルと組み合わせた指向性変異設計を実施し、多様なアプリケーション要件を満たす優れた変異体を得ました。
複数回のシーケンス検証を経て変異体から市場製品へ
ZymeEditor TM酵素進化プラットフォームは、酵素進化技術を通じて、高い熱安定性、高いライブラリ収量、および低いアダプター自己連結を備えた T4 DNA リガーゼ変異体の進化に成功しました。 現在改良された T4 DNA リガーゼ、Hieff® Versatile T4 DNA リガーゼ (600 U/μL) (カタログ番号 12996ES) が発売されました。この製品は、ライゲーション効率と熱安定性の点で従来の野生型 T4 DNA リガーゼを上回り、ハイスループット シーケンシングによって検証されており、優れた品質が保証されています。
データプレゼンテーション
1. 高い熱安定性
Yeasen の T4 DNA リガーゼ変異体を 42℃ で 0、2、4 時間の熱処理にかけ、ベンダー Q、N、A、T の T4 DNA リガーゼと比較しました。その後、Yeasen DNA ライブラリ構築キット (カタログ番号 12927ES) を使用して、1 µg の断片化されたウシ gDNA を使用して全ゲノム DNA ライブラリを構築し、T4 DNA リガーゼの熱安定性を比較しました。
図3 42℃での熱安定性試験
結果：
熱安定性: Yeasen ≈ ベンダー N ≈ ベンダー A > ベンダー T > ベンダー Q。
2. 図書館の収量増加
Yeasen の T4 DNA リガーゼ変異体は、ベンダー Q、N、A、および T の T4 DNA リガーゼと比較して、高および低 DNA 入力レベルの両方でライブラリ収量をテストされました。Yeasen DNA ライブラリ構築キット (カタログ番号 12927ES) を使用し、1 µg および 0.5 ng の断片化されたウシ gDNA を入力して DNA ライブラリを構築しました。
図4 DNAライブラリ収量分析
結果：
ライブラリ収量 (1 µg gDNA): Yeasen > ベンダー Q ≈ ベンダー T ≈ ベンダー A > ベンダー N。ライブラリ収量 (0.5 µg gDNA): Yeasen ≈ ベンダー Q ≈ ベンダー A ≈ ベンダー T > ベンダー N。
3.下部アダプターの自己結紮
Yeasen の T4 DNA リガーゼ変異体を、ベンダー Q、N、A、および T の T4 DNA リガーゼとアダプター自己連結について比較しました。Yeasen DNA ライブラリ構築キット (カタログ番号 12927ES) を使用し、0 ng および 0.5 ng の断片化されたウシ gDNA を入力して、全ゲノム DNA ライブラリを構築しました。
図5 0 ng（左）および0.5 ng（右）のgDNA入力によるアダプター自己ライゲーションデータ
結果：
1) アダプターの自己連結率 (0 ng gDNA): ベンダー N > Yeasen > ベンダー T > ベンダー A > ベンダー Q。
2) アダプターの自己連結率 (0.5 ng gDNA): Yeasen > ベンダー T > ベンダー Q ≈ ベンダー N > ベンダー A。
お問い合わせ
Yeasen は、従来の T4 DNA リガーゼの限界を克服し、熱安定性、ライブラリ収量、アダプター自己ライゲーションに優れた T4 DNA リガーゼ製品を提供しています。この過程で、同社は豊富な変異体ライブラリを蓄積し、さまざまな実験ニーズを満たすさまざまなオプションを研究者に提供しています。当社の製品または T4 DNA リガーゼ変異体にご興味がございましたら、以下の方法でお気軽にお問い合わせください。
メール: order1@yeasen.com (米国)
電話: +1 240-472-6069 (米国)
さらに、YeasenはT4 DNAリガーゼ製品シリーズを提供しています。製品情報については、製品リンクをクリックしてください。
Yeasen T4 DNAリガーゼ製品シリーズ
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製品の位置付け
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製品名
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カタログ番号
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高い熱安定性と低い自己結紮率
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Hieff ®多用途 T4 DNA リガーゼ (600 U/μL)
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12996ES
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迅速かつ効率的なライゲーション、低残留物、病原体検出のニーズに最適です。
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高速T4 DNAリガーゼ（400 U/µL）
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10299ES
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ユニバーサルモデル
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クイック T4 DNA リガーゼ (400 U/µL)
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10301ES
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参考文献
[1] Shuman S.DNAリガーゼ：進歩と展望[J] .Journal of Biological Chemistry、2009、284(26):17365-17369。
