RNase HII は RNase H2 とも呼ばれ、二本鎖 DNA らせん構造内にある単独のリボヌクレオチドの 5' 末端のホスホジエステル結合を特異的に標的として切断するエンドリボヌクレアーゼです。この酵素は、一本鎖 RNA に対しては最小限の切断活性を示し、二本鎖 DNA (dsDNA) と一本鎖 DNA (ssDNA) の両方に対しては不活性です。RNase HII は 50°C ～ 75°C の温度範囲で機能的に活性で、70°C ～ 75°C の温度で最高のパフォーマンスを発揮します。RNase HII は、dsDNA や ssDNA に影響を与えずに、リボヌクレオチドが組み込まれた DNA 部位で標的を絞った単一部位切断を実行する独自の能力を活用し、プライマーの活性化や伸長などの反応開始の精密な「トリガー」として機能し、特定の増幅を実現します。この酵素は、RNase H 依存性 PCR (rhPCR)、ループ介在等温増幅 (LAMP) 技術、および Okazaki フラグメント内の RNA 成分の分解において重要な役割を果たします。

一. RNase H依存性PCR （ rhPCR ）
rhPCR は、RNase HII と特別に設計されたクローズド クリエーブ可能な rhPCR プライマーを PCR プロセスに組み込みます。このアプローチは、RNase HII のユニークな特性を利用して、一本鎖または二本鎖の DNA と RNA のホスホジエステル結合をそのままにしながら、DNA-RNA ハイブリッド内の RNA を選択的に加水分解します。その結果、RNase HII は DNA-RNA ハイブリッドのみを消化し、プライマーがターゲット DNA 配列と完全に相補的である場合にプライマー伸長を可能にします。このターゲットを絞った動作により、反応の精度が大幅に向上します。RNase HII は、リボ核酸の 5' 末端を切断することで突然変異を誘発することなく、リボヌクレオチドの正確な除去を開始できる唯一の酵素です。その高い特異性、感度、再現性により、rhPCR は、一塩基多型 (SNP) 検出、遺伝子タイピング、複数のターゲットの同時検出、環境核酸分析などのアプリケーションで明確な利点を提供します。

テクニカルルート

1. プライマー設計

プライマー設計では、PCR サイクル中にプライマーがテンプレートに安定して結合できるように、切断後の融解温度がアニーリング温度よりも高くなるようにする必要があります。rhPCR プライマーは、次の 3 つの部分で構成されます。

1）5' DNAセグメント：長さと融解温度（Tm）要件が標準PCRプライマーと同等であり、RNase HII酵素によって切断された後、テンプレートDNAと効果的に対になって伸長することができます。

2）単一のRNA塩基：RNase HIIの切断部位を提供します。

3）3' DNAセグメント：4塩基または5塩基の長さで、ブロッカー（通常はプロピレングリコールなどの短くて伸長しない分子）が除去されるまでDNAポリメラーゼの伸長を阻止します。

2.切断と延長

rhPCR 反応の開始時には、プライマーとテンプレート DNA は自由です。プライマーが特定の RNA:DNA ヘテロ二本鎖テンプレートに結合すると、ブロックされたプライマーの RNA 塩基 5' 側が RNase HII 酵素によって認識され、切断され、3'-ヒドロキシル基を持つ DNA オリゴヌクレオチドが残り、DNA ポリメラーゼが伸長するための開始点となります。その後、従来の PCR 増幅プロセスが続きます。

図2 rhPCRの原理図^[1]

２．ループ介在等温増幅法（LAMP法）

ループ介在等温増幅法（LAMP）は、短時間で等温条件下で核酸を増幅できる、シンプルで迅速な遺伝子増幅法です。ただし、室温での準備中に DNA ポリメラーゼの活性が開始されるため、非特異的なミスマッチが形成され、少量のミスペアリングやプライマーダイマーが発生し、軽微な汚染を引き起こし、偽陽性につながる可能性があります。
RNase HII を LAMP 増幅システムに適用すると、LAMP 技術の偽陽性の問題に効果的に対処でき、臨床診断への応用が広がります。図 3 に示すように、RNase HII を使用したプライマー活性化 LAMP 法 (PA-LAMP) では、プライマーがターゲット ssDNA と対になると、RNase HII 酵素がプライマー上の RNA を特異的に切断し、プライマーを活性化してプライマー伸長を可能にし、特異的増幅を実現し、システム内の偽陽性を効果的に削減します。

イエセンRNaseHII

YEASEN の RNase HII (Cat#14539)は、 Pyrococcus abyssi、Pa由来で、汚染ヌクレアーゼ、切断酵素、RNase 残留物が存在せず、宿主 DNA 汚染も低いため、システム内の偽陽性を効果的に減らすことができます。YEASEN の RNase HII は耐熱性が極めて高く、95°C で 30 分後でも活性を維持するため、さまざまな rhPCR 反応システムと互換性があり、LAMP やその他のアプリケーションにも適しています。

1. 大腸菌ゲノムDNA残基<0.5コピー/100U

RNase HII の異なるバッチで大腸菌ゲノム DNA 残留物を検出した結果、YEASEN の RNase HII の宿主ゲノム DNA 残留物は 0.5 コピー/100 U をはるかに下回っていることが示されました。

図4.大腸菌ゲノムDNA残留物の検出

2. 95℃耐熱試験

RNase HIIを95℃で0～45分間加熱した後、RNase HIIの酵素活性を試験しました。その結果、YEASENのRNase HIIは45分間加熱した後でも酵素活性がほとんど失われていないことがわかりました。

図5. 95°C耐熱試験

3. エキソヌクレアーゼ、切断酵素、RNase残留物なし（1単位投与）

RNase HII の異なるバッチ 1 U をそれぞれの基質 DNA/RNA とともに 37°C で 4 時間インキュベートし、アガロースゲル電気泳動の結果、RNase HII にはエキソヌクレアーゼ、切断酵素、または RNase 残留物がないことがわかりました。

図6. エキソヌクレアーゼ、切断酵素、RNase残基の検出結果

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参考文献

[1] Dobosy JR、Rose SD、Beltz KR、Rupp SM、Powers KM、Behlke MA、Walder JA。RNase H依存性PCR（rhPCR）：ブロックされた切断可能なプライマーを使用した特異性と一塩基多型の検出の向上。BMC Biotechnol。2011年8月10日;11:80。doi：10.1186/1472-6750-11-80。

[2] Du WF、Ge JH、Li JJ、et al.プライマー活性化ループ介在等温増幅（PA-LAMP）による一段階、高特異性一塩基変異検出[J]。Analytica chimica acta、2019（1050-）：1050。DOI：10.1016 / j.aca.2018.10.068。