図1. Mg ²⁺およびMn ²⁺存在下でのDNase IによるdsDNAの切断の模式図

一般的な DNase I は、主にウシの膵臓から精製されるか、または組み換え酵素です。ウシの膵臓から精製された DNase I と比較すると、組み換え DNase I は内因性 RNase レベルが比較的低いか、RNase フリー製品として配合できるため、RNA サンプルからの DNA の除去など、RNase に敏感な用途に適しています。

アプリケーション

用途に関しては、DNase I は、DNA を含まない RNA の抽出、逆転写前の gDNA を含まない RNA テンプレートの調製、in vitro 転写後の DNA テンプレートの分解など、RNA の完全性維持に関連する実験での使用がよく知られています。さらに、rRNA 除去における DNA プローブの消化、ニックトランスレーションによる DNA 標識、フットプリント法を使用した DNA-タンパク質相互作用の分析、ランダム DNA ライブラリの生成、細胞溶解物またはタンパク質抽出物の粘度の低下、細胞培養の添加剤としての細胞接着の消化、アポトーシス検出のための TUNEL アッセイの陽性対照としてのゲノム DNA の部分切断にも使用できます。要約すると、DNase I は、DNA の酵素消化を必要とするほぼすべての用途で使用できます。以下では、いくつかの一般的な用途について簡単に紹介します。

• RNA抽出または逆転写前のgDNAの除去

RNA は研究室でよく研究されるサンプルであり、その品質が実験データの品質に大きく影響します。RNA 抽出プロセス中に gDNA の残留を完全に避けることは一般的に不可能です。そのため、難しい下流アプリケーション (mRNA 発現解析、トランスクリプトーム解析など) を実行する前に、通常は RNA サンプルを DNase I で処理して残留 gDNA を消化することが推奨されます。gDNA の消化は、RNA 抽出中、RNA 抽出後、または RNA 逆転写の前に実行できます。

図2. DNase IベースのgDNA除去プロセス

• 試験管内転写におけるテンプレートDNAの除去

インビトロ転写 (IVT) では、主に DNA をテンプレートとして使用し、適切な基質とバッファーの影響下で RNA を生成します。このプロセスで一般的に使用される RNA ポリメラーゼには、RNA 合成を触媒する T7、T3、SP6 などがあります。ただし、合成された RNA 産物には DNA 残基が含まれる場合があり、これらの残基を除去すると下流の実験に役立ちます。

特に mRNA ワクチンの開発プロセスでは、これらの DNA 残留物を除去することは、その後の精製プロセスの難しさや最終製品の純度に直接影響する重要なステップです。テンプレート DNA を効率的に除去するために、通常は DNase I 処理を使用して RNA サンプルに DNA 残留物が残らないようにします。このステップは、実験の全体的な精度と効率を向上させるのに役立ちます。

図3: 線状化プラスミドをテンプレートとして用いたin vitro転写プロセス^[4]

• RNAライブラリ構築と配列決定におけるrRNAの除去

生物において、rRNA は非常に豊富で高度に保存されているため、生物学的情報研究の取得にはあまり意味がありません。ただし、実験中に抽出される全 RNA の 95% はヒト rRNA であり、これらの rRNA の存在はターゲット RNA の検出を妨げる可能性があります。そのため、RNA ライブラリの準備と配列決定では、通常、最初に rRNA が除去されます。現在、rRNA 除去の主な方法は RNAase 消化であり、その主な操作手順と原理は次のとおりです。

1. 全RNAを抽出します。
2. 一本鎖 DNA プローブを rRNA 分子とハイブリダイズします (注: rRNA 固有の一本鎖 DNA プローブを設計および合成します)。
3. RNase H はハイブリダイズした rRNA を分解します。
4. DNase I は DNA プローブを分解します。
5. rRNA は正常に除去され、非 rRNA RNA テンプレートが残ります。

図4: 酵素法によるrRNA除去原理の模式図^[5]

• DNAラベリングのためのニック翻訳

ニックトランスレーションは、実験室でデオキシリボ核酸プローブを標識するために最も一般的に使用される方法です。この方法は、DNase I とE.coli DNA ポリメラーゼ I の複合作用によって実現されます。

主な原則は次のとおりです。

1. まず、適切な濃度の DNase I を使用して、ラベル付けする二本鎖 DNA の各鎖に複数の一本鎖の切れ目を作成し、切れ目部位に 3' ヒドロキシル末端を形成します。
2. 次に、大腸菌DNA ポリメラーゼ I の 5'→3' エキソヌクレアーゼ活性を使用してニックの 5' 末端からヌクレオチドを除去し、大腸菌 DNA ポリメラーゼIの 5'→3' ポリメラーゼ活性を使用してニックの 5' 末端からヌクレオチドを除去します。 大腸菌DNA ポリメラーゼ I は、ニックの 3' 末端に標識ヌクレオチドを導入して修復します。ニックが DNA 鎖に沿って移動すると、標識ヌクレオチドが新しく合成された DNA 鎖に組み込まれます。

図5: ニックトランスレーションによるDNA標識の原理の模式図^[6]

• DNase Iフットプリントアッセイ実験

DNase I フットプリント アッセイは、DNA 分子上の DNA 結合タンパク質の結合部位を正確に特定する方法です。原理は、DNA 断片に結合したタンパク質が結合領域を DNase I による分解から保護することです。酵素消化後、残った断片 (「フットプリント」) を使用してその配列を判定できます。ゲル画像には、タンパク質が結合している領域に対応するバンドはありません。

主な原則は次のとおりです。

1. 検査する二本鎖 DNA 分子の一本鎖末端にラベルを付けます。
2. タンパク質を DNA と混合し、適切な量の DNase I を加えて酵素消化し、さまざまな長さの DNA 断片を形成します。酵素の量は、隣接する DNA 断片のヌクレオチドが 1 つだけ異なるように制御する必要があり、タンパク質を添加していないコントロールも並行して含める必要があります。
3. DNA からタンパク質を除去し、変性 DNA を PAGE 電気泳動で分離し、オートラジオグラフィーで撮影して、コントロール グループと比較してフットプリント領域のヌクレオチド配列を解釈します。

図6: DNase Iフットプリントアッセイの原理の模式図^[7]

YeasenのDNase I選択ガイド

Yeasen は、さまざまなアプリケーションのニーズを満たすために、大腸菌の組み換え DNase I を提供しており、mRNA の in vitro 転写やその他のアプリケーションの要件を満たす GMP グレードの DNase I を提供することができます。

製品の位置付け	応用	製品名	カタログ番号
RNaseフリー	RNAおよびタンパク質調製物からDNAを除去する	組み換えDNase I（RNaseフリー）	10325ES
GMPグレード、RNaseフリー	mRNAのin vitro転写	UCF.ME® デオキシリボヌクレアーゼ I (DNase I) GMP グレード	10611ES

参考文献

[1] Ndiaye C, Mena M, Alemany L, et al. 頭頸部癌におけるHPV DNA、E6/E7 mRNA、p16INK4aの検出：系統的レビューとメタアナリシス[J]. The Lancet Oncology, 2014, 15(12): 1319-1331.

[2] Broccolo F, Fusetti L, Rosini S, et al. 子宮頸部サンプルにおける発がん性HPV型特異的ウイルスDNA量とE6/E7 mRNA検出の比較：多施設共同研究の結果[J]。医学ウイルス学ジャーナル、2013年、85(3):472-482。

[3] Huang Z、Fasco MJ、Kaminsky L S.定量的RNA-PCRに使用するためのRNAからの汚染DNAのDNase I除去の最適化[J]。Biotechniques、1996、20（6）：1012-1020。

[4] Kang DD、Li H、Dong Y.臨床への応用を可能にするin vitro転写mRNA（IVT mRNA）の進歩[J]。Advanced Drug Delivery Reviews、2023、199：114961。

[5] Wiame I、Remy S、Swennen R、et al. RNA分解を伴わないDNase Iの不可逆的熱不活性化[J]. Biotechniques、2000、29(2):252-256。

[6] Adolph S, Hameister H. ビオチン標識d-UTPによる中期染色体のin situニックトランスレーション[J]. ヒト遺伝学, 1985, 69: 117-121.

[7] Song C、Zhang S、Huang H.微生物ゲノムの複製起点の同定に適した方法の選択。Front Microbiol、2015、6：1049。