生物学におけるテロメアとプロテロメラーゼについて考えるとき、多くの人がまず思い浮かべるのは、避けられない自然現象である老化です。テロメアは真核生物の染色体の末端にある反復 DNA 配列であり、染色体の完全性を維持し、細胞分裂周期を調節する役割を担っています。
プロテロメラーゼは、テロメアを延長する逆転写 DNA 合成酵素です。これは、RNA とタンパク質で構成される核タンパク質です。タンパク質成分は、RNA 成分とともにテロメア反復配列の合成を触媒することができます。
図1. プロテロメラーゼによるテロメア伸長のメカニズム[1]
プロテロメラーゼはテロメアを修復して延長し、DNA複製の欠陥を補い、細胞分裂中のテロメア損失を防ぎ、細胞分裂回数を増やすことができます。2009年、細胞機能と老化におけるテロメアとプロテロメラーゼの重要な役割を明らかにしたエリザベス H ブラックバーン、キャロル W グライダー、ジャック W ショスタックの3人に、ノーベル生理学・医学賞が授与されました。
今日は、ユニークなプロテロメラーゼ、TelN プロプロテロメラーゼをご紹介します。TelN プロテロメラーゼはバクテリオファージ N15 に由来し、N15 複製システムの構成要素で、線状プロファージ DNA の生成に関与しています。真核生物のプロテロメラーゼとは異なり、TelN は RNA 構成要素を含まない純粋なタンパク質酵素です。切断-連結活性があり、二本鎖 DNA (dsDNA) を切断した後、切断部位に共有結合で閉じた末端を残します。
図2. TelNプロテロメラーゼ切断部位
TelNプロテロメラーゼの作用機序
TelN プロテロメラーゼの認識部位は、両側に telR と telL がある 56 bp の長さの回文配列です。ターゲット配列の中央位置も回文配列 telO です。TelN プロテロメラーゼは telO 配列内で切断し、2 つの切断端で共有結合で閉じたヘアピン構造を形成します。消化後の DNA の末端は依然として telR と telL で構成されており、ドギーボーン DNA (dbDNA) として知られています。
図3. TelN部位におけるプロテロメラーゼ切断機構[2]
TelNプロテロメラーゼの特殊な酵素切断-連結活性により、環状プラスミドDNAはワンステップ酵素反応で共有結合で閉じた直線状のダンベル型分子に変換できます。直線状の開いたDNA分子と比較して、直線状の閉じたDNAは細胞内でのタンパク質発現レベルが高く、安定性が高く外来配列が最小限の直線状の閉じた末端のミニDNAの構築に非常に適しています。プラスミドDNAは、mRNAワクチン、DNAワクチン、細胞遺伝子治療の中核要素として重要な役割を果たしています。従来のプラスミド製造方法は、大腸菌による発酵と多段階の増幅を伴い、発酵プロセスにおける制御不能なリスクにより高品質のプラスミドの収量が制限され、ワクチンの生産能力を制限する鍵となります。英国のタッチライト社は革新的なdbDNA技術を発表しました。この技術は、プラスミドDNA調製のための従来の細菌発酵方法を破壊し、代わりにDNAのin vitro酵素合成を使用します。上記の方法では、TelN プロテロメラーゼの特殊な酵素切断連結活性も利用して、線状閉鎖末端ミニ DNA を生成します。
DNA酵素合成におけるTelNプロテロメラーゼの応用
phi29 DNAポリメラーゼとTelNプロテロメラーゼに基づくDNA in vitro酵素法は、生物学的発酵プロセスにおける多くの制御不能なリスクを回避でき、in vitro酵素法は高速かつ高収率でDNAを合成できます。合成されたDNAは、mRNAワクチン、DNAワクチン、遺伝子治療ベクター、遺伝子編集など、多くの新興技術に使用できます。
図4. DNA酵素合成のフローチャート[3]
酵素によるDNA合成プロセス
- テンプレートの変性
環状プラスミド DNA テンプレートは、変性プロセスによって 2 つの一本鎖環状 DNA に変換されます。
- ローリングサークル増幅
Phi29 DNA ポリメラーゼと一本鎖環状 DNA を使用してローリング サークル増幅を実行し、プロテロメラーゼ認識配列間隔を持つ長い線状二本鎖連結 DNA を生成しました。
- 切断と共有結合による閉鎖
TelN プロテロメラーゼは、テロメア複合体の DNA 上の telRL を認識し、切断-連結活性を実行して、線状の共有結合した DNA モノマーを生成します。
- 細菌骨格DNAの除去
制限酵素またはエキソヌクレアーゼは、末端に開放構造を持つ細菌骨格DNAを分解し、標的遺伝子発現要素のみを含むDNAを得ます。DNA酵素合成技術は、生物学的発酵を回避し、GMPレベルのプラスミドDNA合成を迅速に達成できるため、遺伝子治療やmRNAワクチンの分野での生産能力の限界を解決し、産業化に大きな可能性を秘めています。DNA酵素合成技術の発展を促進するため、YEASEN Biologyは、phi29 DNAポリメラーゼ（14404ES）やTelNプロテロメラーゼ（14540ES）などのDNA酵素合成用コア酵素材料を提供し、DNA酵素合成技術の研究と生産を支援します。
YEASENのTelNプロテロメラーゼの性能プレゼンテーション
- 切断結紮性能は優れており、輸入ブランドと同等です。
TelN プロテロメラーゼ認識部位を含むスーパーコイルプラスミドをテンプレートとして使用し、YEASEN とブランド A の勾配添加 (0.078-5 U) 酵素を加えました。0.5 μg のスーパーコイルプラスミドが閉じた線状二本鎖 DNA (dsDNA) に変換されました。ゲル電気泳動を使用して変換効率を検出した結果、YEASEN の TelN プロテロメラーゼの切断および連結活性はブランド A と同等であることが示されました。
図5. TelNのプロテロメラーゼ切断活性検出 M:マーカー、C:スーパーコイルプラスミドコントロール
- 線状dsDNAの閉鎖完全性 > 90%
TelN プロテロメラーゼ認識部位を含むスーパーコイルプラスミドをテンプレートとして使用し、YEASEN の TelN プロテロメラーゼとブランド A を加え、0.5 μg のスーパーコイルプラスミドを閉じた線状 dsDNA に変換し、T5 エキソヌクレアーゼを加えてバンド分解度によって末端の完全性を検出しました。結果は、YEASEN の TleN プロテロメラーゼによって生成された dsDNA 末端閉鎖完全性が 90% を超え、ブランド A と同等であることを示しました。
図 6. TelN プロテロメラーゼ末端閉鎖完全性テスト。C1: TelN 認識部位を含むプラスミド (TelN プロテロメラーゼなし)。C2: TelN 認識部位、TelN プロテロメラーゼを含むプラスミド (T5 エキソヌクレアーゼなし)。プラスミド: TelN 認識部位を含むプラスミド。
DNA酵素合成関連製品
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製品分類 |
製品名 |
カタログNo. |
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プロテロメラーゼ |
14540ES |
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Phi29 DNAポリメラーゼ |
14404ES |
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エキソヌクレアーゼ |
エキソヌクレアーゼIII |
14525ES |
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14538ES |
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dNTP |
10125ES |
参照
[1] ジャルディーニ MA、セガット M、ダ・シルバ MS、ヌネス VS、カノ MI。テロメアとプロテロメラーゼの生物学。 Prog Mol Biol Transl Sci. 2014;125:1-40。
[2] Heinrich J、Schultz J、Bosse M、Ziegelin G、Lanka E、Moelling K. 原核生物の切断結合酵素TelNによって生成された線状閉鎖ミニDNAは哺乳類細胞で機能する。J Mol Med (Berl)。2002;80(10):648-654。
[3] Heinrich J、Schultz J、Bosse M、Ziegelin G、Lanka E、Moelling K. 原核生物の切断結合酵素TelNによって生成された線状閉鎖ミニDNAは哺乳類細胞で機能する。J Mol Med (Berl)。2002;80(10):648-654。doi:10.1007/s00109-002-0362-2。